復合酶法制備澳洲堅果蛋白肽及其抗氧化活性研究

帥希祥 張明 馬飛躍 杜麗清 李秋紅 涂行浩

摘 ?要：本研究以前期制備的澳洲堅果蛋白為原料，經復合酶（木瓜蛋白酶和中性蛋白酶）酶解制備澳洲堅果蛋白肽，采用水解度為指標，利用單因素試驗與正交試驗考察各酶解因素對澳洲堅果蛋白水解度的影響，同時通過不同分子量（3、10、30?kDa）的超濾離心管對制備的蛋白肽進行初步的分離，并基于DPPH自由基清除能力對不同分子量的澳洲堅果蛋白肽的抗氧化活性進行評價。結果表明：各酶解因素對復合酶酶解制備澳洲堅果蛋白水解度的影響依次為酶解初始pH>復合酶配比>酶添加量>酶解時間;最佳復合酶酶解條件為復合酶配比1∶5、酶添加量12?000?U/g、酶解液初始pH?9.0、酶解時間360?min，在此條件下澳洲堅果蛋白的水解度為21.88%;同時，通過分析不同分子量的澳洲堅果蛋白肽組分發現，不同分子量的澳洲堅果蛋白肽均具有抗氧化活性，分子量在3～10?kDa的肽段組分具有較強的抗氧化能力，其DPPH自由基清除能力達到80.97%，且隨著蛋白肽組分濃度的增加，其抗氧化能力也逐漸增強。

關鍵詞：澳洲堅果;蛋白肽;酶解;抗氧化活性中圖分類號：S664.9??????文獻標識碼：A

Preparation and Antioxidant Activities of Macadamia Nut Peptides by Combined Enzymatic Hydrolysis

SHUAI Xixiang¹，?ZHANG Ming¹，?MA Feiyue¹，?DU Liqing^1*，?LI Qiuhong²，?TU Xinghao¹

1. South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences?/ Key Laboratory of Tropical Fruit Biology，?Ministry of Agriculture?and Rural Affairs， Zhanjiang， Guangdong 524091， China; 2. School of Chemical and Biological Engineering， Yichun University， Yichun， Jiangxi?336000， China

Abstract： In this paper， the macadamia protein peptide were obtained from the?macadamia protein?prepared by the enzyme mixture treatment. The effects of various factors on the protein hydrolysis degree of macadamia nuts were investigated by the single factor test and orthogonal test.?At the same time，?the preliminary separation of the?protein peptide was carried out by ultrafiltration centrifuge tubes （3， 10， 30 kDa） with different molecular weights.?Then，?the antioxidant activity of macadamia nut peptide with different molecular weight was evaluated by DPPH scavenging activity. Results showed that order of the factors was as follows： initial pH?> enzyme mixture rate > enzyme concentration >?hydrolysis duration. The optimal conditions were as follows：?enzyme mixture rate （papain protease and neutral protease）?1∶5，?enzyme concentration 12?000 U/g， initial pH 9.0， hydrolysis duration?360 min. Under the optimized condition， the hydrolysis degree of macadamia nut protein was 21.88%.?It was found that macadamia nut peptide with different molecular weight had?antioxidant activities， and the strongest was the 3～10 kDa peptide. And the DPPH free radical scavenging ability reached 80.97%. As the concentration of the protein peptide component increased， its antioxidant activity also increased.

Keywords： macadamia nut; peptide; enzymatic hydrolysis; antioxidant activity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.07.021

澳洲堅果（Macadamia ternifoliaF.?Muell.）別名澳洲核桃、夏威夷果等，屬山龍眼科（Prote ac eae）澳洲堅果屬^[1-2]。澳洲堅果營養豐富，不含膽固醇，果仁酥脆可口，是世界上品質上乘的可食木本堅果^[3]。目前在中國的云南、廣西、貴州等地均有種植，隨著我國澳洲堅果的大量種植，澳洲堅果資源越來越豐富。但目前，澳洲堅果主要以殼果和果仁等初級加工產品的形式出售，一些次果主要用于榨油，榨油后的副產物澳洲堅果餅粕中含有較高含量的蛋白質（32.25%），且富含有17種氨基酸，總含量為25.05%^[4-6]。目前對于澳洲堅果餅粕蛋白質的研究還只停留在優化提取工藝和評價所得蛋白質的功能特性上^[7]，而對于利用澳洲堅果蛋白來制備生物活性肽及對其性質并沒有進行過深入研究。因此，通過生物酶解制備生物活性肽是提高澳洲堅果餅粕利用率的有效途徑之一。

生物活性肽是源于蛋白質的多功能化合物，它是由2個或2個以上氨基酸通過肽鍵連接而形成的化合物，因其組成和排列不同而形成了種類不同的蛋白肽^[8]。蛋白肽除具有易被消化吸收的特性外，還具有許多蛋白質所不具有的特殊生理功能特性，包括抗氧化^[9-11]、降血壓^[12]、免疫調節^[13]等。

本研究以前期制備的澳洲堅果蛋白為原料，以水解度為指標，利用單因素和正交試驗優化酶解制備澳洲堅果蛋白肽工藝，同時采用超濾技術對制備的澳洲堅果蛋白肽進行初步的純化，得到4種不同分子量的蛋白肽組分，基于DPPH自由基清除能力對其不同組分抗氧化能力進行評價，以期為澳洲堅果蛋白的高值化利用及開發高效的食品抗氧化劑提供一定的理論依據。

1??材料與方法

1.1 材料

1.1.1 ?材料與試劑??澳洲堅果餅粕由國家重要熱帶作物工程技術研發中心澳洲堅果果品加工中試基地提供;木瓜蛋白酶（活力≥6000?U/mg）、中性蛋白酶（活力為100?U/mg）、絲氨酸（99.99%）、DPPH（≥97%）;氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇等均為分析純，由國藥集團化學試劑有限公司提供。

1.1.2??儀器與設備??主要實驗儀器與設備如表1所示。

1.2方法

1.2.1 ?澳洲堅果蛋白制備??采用堿提酸沉法，具體提取工藝條件參照帥希祥等^[14]。

1.2.2??澳洲堅果蛋白酶解工藝流程??澳洲堅果蛋白溶液→90?℃水浴攪拌10 min→室溫冷卻→調節溶液pH→加酶→50?℃恒溫水浴酶解→沸水滅酶15 min→高速離心→取上清液→濃縮→凍干→澳洲堅果蛋白肽粉。

1.2.3??澳洲堅果蛋白酶解液中蛋白肽含量的測定??參照Pedroche等^[15]和Nielsen等^[16]報道的o-鄰苯二甲醛法（OPA）進行測定。

澳洲堅果蛋白水解度按下列公式計算：

式中，DH為澳洲堅果蛋白水解度（%）;A為復合酶酶解的澳洲堅果蛋白酶解液中蛋白肽含量（μg/g）;B為充分水解的澳洲堅果蛋白中蛋白肽的含量（μg/g）。

1.2.4??澳洲堅果蛋白酶解制備蛋白肽單因素試驗??（1）復合酶配比對澳洲堅果蛋白水解度的影響。各取0.30?g?按1.2.1方法制備的澳洲堅果蛋白置于9個100?mL錐形瓶中，各加入30 mL蒸餾水，調節溶液pH 7.0，分別加入3000 U/g復合酶（木瓜蛋白酶和中性蛋白酶配比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1），然后將其置于恒溫水浴（50?℃、800 r/min）中酶解150?min，酶解結束后，將酶解液進行滅酶處理（90?℃水浴中滅酶15?min），然后在室溫下冷卻，在8000?r/min下進行高速離心，取上清液，分析不同復合酶配比對澳洲堅果蛋白水解度的影響。

（2）酶解液初始pH對澳洲堅果蛋白水解度的影響。按上述（1）方法配置澳洲堅果蛋白溶液，用1.0 mol/L的氫氧化鈉或鹽酸分別調節溶液pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，加入3000?U/g復合酶（木瓜蛋白酶和中性蛋白酶配比為1∶4），將其置于恒溫水浴（50?℃、800?r/min）中酶解150?min，酶解結束后，按上述（1）操作處理酶解液，分析不同酶解液初始pH對澳洲堅果蛋白水解度的影響。

（3）酶添加量對澳洲堅果蛋白水解度的影響。按上述（1）方法配置澳洲堅果蛋白溶液，調節溶液pH為8.0，分別加入3000、6000、9000、12000、15000?U/g復合酶（木瓜蛋白酶和中性蛋白酶配比為1∶4），將其置于恒溫水浴（50?℃、800 r/min）中酶解150 min，酶解結束后，按上述（1）操作處理酶解液，分析不同加酶量對澳洲堅果蛋白水解度的影響。

（4）酶解時間對澳洲堅果蛋白水解度的影響。按上述（1）方法配置澳洲堅果蛋白溶液，調節溶液pH為8.0，加入12?000 U/g復合酶（木瓜蛋白酶和中性蛋白酶配比為1∶4），將其置于恒溫水浴（50?℃、800?r/min）中酶解不同時間（分別為0、30、60、120、240、360、480?min），酶解結束后，按上述（1）操作處理酶解液，分析不同酶解時間對澳洲堅果蛋白水解度的影響。

1.2.5 ?澳洲堅果蛋白酶解工藝優化正交試驗??在澳洲堅果蛋白酶解單因素試驗的基礎上，以水解度為指標，選用L₉（3⁴）進行正交試驗來優化澳洲堅果蛋白酶解工藝條件，選用因素分別為復合酶配比（A）、酶解液初始pH（B）、加酶量（C）、酶解時間（D），每個因素選擇3個水平。

1.2.6??不同分子量澳洲堅果蛋白肽的制備方法??選擇截留分子量分別為1、3、10、30 kDa的超濾膜對制備的澳洲堅果蛋白酶解液進行超濾處理，得到4種不同分子量的澳洲堅果蛋白肽組分（1～3、3～10、10～30、30?kDa以上），經冷凍干燥得到不同分子量澳洲堅果蛋白肽粉，備用。

1.2.7??澳洲堅果蛋白肽清除DPPH自由基能力評價??準確稱取1.2.6制備的4種蛋白肽粉各0.1000?g，用蒸餾水配置成4?mg/mL的蛋白肽溶液，按表2添加各試劑^[17]。

按表2將各試劑加入到試管中，充分混勻，于暗處反應7?min，在517?nm下測定吸光值。以蒸餾水作為空白對照組。按下列公式計算其清除率：

式中，A₁為復合酶酶解澳洲堅果蛋白酶解液清除DPPH自由基的吸光值;A₀為對照組清除DPPH自由基的吸光值。

1.3數據處理

采用SPSS 17.0軟件對試驗數據進行分析，結果以平均值±標準偏差來表示，采用Origin 8.0軟件對分析后的數據作圖。所有試驗均設置3次重復。

2 ?結果與分析

2.1澳洲堅果蛋白酶解工藝優化單因素試驗

2.1.1??酶添加比例對澳洲堅果蛋白水解度的影響??通過絲氨酸標準曲線的繪制，得到其標準曲線方程為y=0.0009x+0.1793（x為絲氨酸的含量，單位為μg/mL;y是吸光度，R²=0.9972）。由圖1可知，澳洲堅果蛋白水解度隨著中性蛋白酶比例的增加而增大，當酶添加比例為1∶4時，澳洲堅果蛋白水解度最大，達到11.95%，而當木瓜蛋白酶比例大于中性蛋白酶時，水解度反而降低，這可能與酶的種類及特異性存在一定的關系。綜合各方面因素考慮，復合酶酶解澳洲堅果蛋白的最適酶添加比例（木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶）為1∶4，在此條件下澳洲堅果蛋白的水解度為11.95%。

2.1.2??酶解液初始pH對澳洲堅果蛋白水解度的影響??由圖2可知，澳洲堅果蛋白水解度在酶解液初始pH為5～8時，隨著pH的升高而增大，當pH達到8.0時，其水解度最大，為19.58%。這可能是由于在pH值較低時，澳洲堅果蛋白的溶解度較低，使得酶與底物接觸不充分，導致水解度較低;而隨著pH升高，澳洲堅果蛋白的溶解度逐漸增大，使得酶可以和底物充分反應，因此澳洲堅果蛋白水解度增加。綜合各方面因素考慮，復合酶酶解澳洲堅果蛋白的最適初始pH在8.0左右，在此條件下澳洲堅果蛋白的水解度為19.58%。

2.1.3 ?酶添加量對澳洲堅果蛋白水解度的影響??由圖3可知，隨著酶添加量的不斷增加，澳洲堅果蛋白的水解度呈逐漸增加的趨勢，但水解度的增加幅度逐漸減弱，當酶添加量增加到12?000 U/g時，其水解度達16.62%;繼續增加酶添加量，蛋白水解度增加不顯著。這可能是因為酶添加量的增加，加大了酶與反應底物的接觸面積，使得其反應更加充分，所以水解度會不斷增大;而當酶添加量增加到一定程度時，在底物濃度一定的情況下，即使增加酶添加量也不會使得反應的速率增加，到最后會逐漸趨于穩定。綜合各方面因素考慮，復合酶酶解澳洲堅果蛋白最適酶添加量為12?000?U/g左右，在此條件下澳洲堅果蛋白水解度為16.62%。

2.1.4??酶解時間對澳洲堅果蛋白水解度的影響??由圖4可知，隨著復合酶酶解時間的增加，澳洲堅果蛋白酶的水解度不斷增大，在360?min時達到最大值，為20.72%，之后便趨于平緩。這可能是因為反應初期，底物含量高，可以充分與酶反應，所以隨著時間的不斷延長，其水解度逐漸增大;而隨著反應的進行，反應產物不斷積累，酶的活性受到抑制，導致蛋白水解度趨于平緩。綜合各方面因素考慮，復合酶酶解澳洲堅果蛋白最

適酶解時間為360?min左右，在此條件下澳洲堅果蛋白水解度為20.72%。

2.2澳洲堅果蛋白酶解正交試驗分析

根據上述單因素實驗結果，選擇復合酶配比（A）、酶添加量（B）、pH（C）、酶解時間（D）4個因素，每個因素選3個水平。用L₉（3⁴）進行正交優化實驗，來確定澳洲堅果蛋白酶解的最佳工藝條件。正交實驗設計見表3，結果見表4。