小干擾RNA的納米藥物輸送系統(tǒng)及其用于癌癥治療的研究

摘 要：目的：研究小干擾RNA的納米藥物輸送系統(tǒng)及其在癌癥治療中的應(yīng)用。方法：制備給藥體系，分析納米顆粒分散度，借助于小鼠模型，分析納米顆粒對腫瘤細胞生長和凋亡的影響。結(jié)果：將納米顆粒懸于胎牛血清培養(yǎng)基中，使用動態(tài)光散射方法對粒徑以及分散度進行檢查。在72h內(nèi)，分散度相對穩(wěn)定，納米顆粒具有良好的穩(wěn)定性。將siPlk1和HepG2細胞進行培養(yǎng)，經(jīng)染色處理后使用流式細胞術(shù)，由于輸送siPlk1后，對癌細胞HepG2的Plk1基因表達起到下調(diào)作用，從而促進癌細胞的凋亡。利用小鼠乳腺癌細胞模型，向小鼠靜脈注射siPlk1納米顆粒，觀察腫瘤生長情況，包載siPlk1納米顆粒具有抑制腫瘤生長的作用，組間差異顯著（P<0.05）。結(jié)論：通過PEG化規(guī)避和蛋白互相發(fā)生作用，避免受到免疫系統(tǒng)的清除，能夠大量聚集在腫瘤位置，實現(xiàn)靶向治療，對腫瘤細胞生長起到抑制作用。

關(guān)鍵詞：納米藥物;輸送系統(tǒng);siRNA;癌癥治療

中圖分類號：R730.5 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2020）07-0201-02

0 引言

PLK1是一種調(diào)控有絲分裂的激酶，乳腺癌患者體內(nèi)過度表達，抑制PLK1表達，腫瘤細胞敏感度可有效提高[1]。利用RNA干擾技術(shù)對PLK1的表達抑制，有助于利用siRNA抑制PLK1表達，對乳腺癌細胞增殖起到抑制作用。在癌癥治療的siRNA藥物中，常使用陽離子脂質(zhì)體作為包載層，但有研究提出應(yīng)用高分子聚合物在給藥傳輸體系中，能夠有機結(jié)合siRNA藥物和靶向細胞，提高輸送藥物效果，引導(dǎo)藥物在腫瘤病變區(qū)域聚集，對充分發(fā)揮療效，提高治療作用有積極作用。因此本文對siRNA給藥體系及癌癥治療的應(yīng)用作一研究如下：

1 資料與方法

1.1 試驗材料

準備陽離子脂質(zhì)、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液、PLK1抗體、PLK1正義鏈等。

1.2 方法

驗證納米顆粒穩(wěn)定性，需要將納米顆粒siRNA和牛血清蛋白，在PBS溶液中混合，經(jīng)過0h、12h、24h、36h、48h、72h的培養(yǎng)后，對納米顆粒分散度進行動態(tài)光散射的檢測。將癌癥細胞終止與培養(yǎng)板中，在37℃恒溫環(huán)境下進行培養(yǎng)，24h后，更換為包載和未經(jīng)包載的siPlk1溶液，進行2h培養(yǎng)后，替換為完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)46h后，使用PBS清洗2次，對細胞進行收集和消化，使用流式細胞計數(shù)儀進行檢測。對雌性裸鼠乳腺脂肪墊接種癌癥細胞，14d后可形成腫瘤，體積約為100mm3。經(jīng)尾靜脈注射不同納米顆粒溶液，給藥24h后，處死小鼠，取出腫瘤組織后，使用活體成像儀對腫瘤區(qū)域的富集進行檢測。提取腫瘤組織后，使用多聚甲醛處理后，使用蔗糖溶液過夜處理。制作腫瘤切片，使用DPAI復(fù)染，使用激光檢查siRNA的分布情況。建立原位模型后，取五組小鼠，每天注射藥物，在移植14d、移植18d、移植22d、移植26d后，分別測量腫瘤體積。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0軟件處理數(shù)據(jù)，使用t和檢驗資料，P<0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 納米顆粒穩(wěn)定性

將納米顆粒懸于胎牛血清培養(yǎng)基中，使用動態(tài)光散射方法對粒徑以及分散度進行檢查。經(jīng)過觀察發(fā)現(xiàn)納米顆粒的粒徑可在72h內(nèi)保持穩(wěn)定，代表顆粒PEG鏈段具有非特異性吸附阻止作用。詳見表1。

2.2 納米顆粒輸送siPlk1對癌細胞凋亡的影響

將siPlk1和HepG2細胞進行培養(yǎng)，經(jīng)染色處理后使用流式細胞術(shù)，分析對癌細胞的影響。將siPlk1輸送至癌細胞中，可發(fā)現(xiàn)癌細胞大量凋亡，凋亡比例和輸送劑量存在直接關(guān)聯(lián)。未經(jīng)包載的siPlk1顆粒未見癌細胞凋亡。由于輸送siPlk1后，對癌細胞HepG2的Plk1基因表達起到下調(diào)作用，從而促進癌細胞的凋亡。

2.3 納米顆粒對癌細胞生長的影響

包載siPlk1納米顆粒具有抑制腫瘤生長的作用，而裸siPlk1、空白納米顆粒均無法達到抑制腫瘤生長的作用，組間差異顯著（P<0.05）。詳見表2。

3 討論

siRNA在腫瘤治療中具有特異性和高效性的作用優(yōu)勢，逐漸在多種腫瘤治療中應(yīng)用，取得了理想的治療效果[2]。siRNA通過對腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移以及傳導(dǎo)起到抑制作用，從而達到治療的目的。其治療原理為在特定細胞中導(dǎo)入RNA后，誘導(dǎo)目標基因沉默，從而降低基因活性[3]。由于siRNA能夠特異性下調(diào)特定基因表達，該技術(shù)也逐漸應(yīng)用于治療惡性腫瘤疾病中，尤其是腫瘤、艾滋病等疾病的治療中，可達到理想的治療效果[4]。目前研發(fā)siRNA藥物遇到了輸送系統(tǒng)的難題，在siRNA藥物中普遍應(yīng)用陽離子聚合物作為給藥系統(tǒng)。但是這類載體很難改善療效，由于陽離子聚合物聯(lián)合siRNA所攜帶的納米顆粒會和血清蛋白發(fā)生相互作用，造成顆粒聚集，被免疫系統(tǒng)清除，很難作用于目標癌癥細胞[5]。很多研究提出，對納米顆粒進行穩(wěn)定化處理，避免受到免疫系統(tǒng)的清除，有助于延長納米顆粒循環(huán)時間，在EPR效應(yīng)的作用下，能夠富集在腫瘤部位，造成靶基因效率降低，對腫瘤生長效果產(chǎn)生負面影響[6]。大部分腫瘤細胞生存在微酸性缺氧環(huán)境中，有研究提出，在pH低于8.0的環(huán)境中，納米細胞PEG層脫掉，帶正電表面被重新暴露，在腫瘤環(huán)境中，納米顆粒脫掉PEG層，可以大量聚集在腫瘤部位，實現(xiàn)大量被腫瘤細胞攝取。

對siRNA和陽離子聚合物包裹PEG化高分子，到達病灶位置脫去高分子層，暴露siRNA以及陽離子聚合物構(gòu)成的納米顆粒，可有效避免RNA干擾，提高腫瘤細胞攝取率[7]。在這一給藥體系下，通過靜脈給藥，在PEG的修飾作用下，能夠減少血清蛋白的相互作用，讓藥物在患者體內(nèi)的時間延長，能夠聚集在腫瘤病變位置，進而達到理想的治療效果[8]。在EPR效應(yīng)作用下，納米顆粒可以大量在腫瘤部位聚集，腫瘤微酸性環(huán)境，能夠促進脫落PEG殼，讓納米顆粒充分暴露，實現(xiàn)大量查殺腫瘤細胞，實現(xiàn)更高的靶向表達，對腫瘤細胞的繁殖和生長起到抑制作用[9-10]。將納米顆粒懸于胎牛血清培養(yǎng)基中，使用動態(tài)光散射方法對粒徑以及分散度進行檢查。經(jīng)過觀察發(fā)現(xiàn)納米顆粒的粒徑可在72h內(nèi)保持穩(wěn)定，代表顆粒PEG鏈段具有非特異性吸附阻止作用[11]。

癌癥基因PLK1的過度表達形成了腫瘤，對PLK1表達抑制，能夠阻礙癌癥細胞有絲分裂，從而促進細胞凋亡。將siPlk1和HepG2細胞進行培養(yǎng)，經(jīng)染色處理后使用流式細胞術(shù)，分析對癌細胞的影響[12]。將siPlk1輸送至癌細胞中，可發(fā)現(xiàn)癌細胞大量凋亡，凋亡比例和輸送劑量存在直接關(guān)聯(lián)。未經(jīng)包載的siPlk1顆粒未見癌細胞凋亡[13]。根據(jù)凋亡結(jié)果驗證了siPlk1能夠結(jié)合癌癥細胞表面受體，內(nèi)吞納米顆粒，促進納米顆粒的攝取，增加納米顆粒輸送，促進siPlk1沉默[14]。在此基礎(chǔ)上促進癌癥細胞凋亡，對癌癥細胞增值起到抑制作用。

利用小鼠乳腺癌細胞模型，向小鼠靜脈注射siPlk1納米顆粒，并未觀測到腫瘤細胞的生長。包載siPlk1納米顆粒具有抑制腫瘤生長的作用，而裸siPlk1、空白納米顆粒均無法達到抑制腫瘤生長的作用，組間差異顯著（P<0.05）。研究證實除包載siPlk1納米顆粒組外，其他兩組均不能對腫瘤細胞生長起到抑制作用[15]。靶向納米顆粒在EPR作用下，在腫瘤部位富集，腫瘤細胞表面高表達的受體能夠和納米顆粒抗體結(jié)合，內(nèi)吞納米顆粒，增加攝取量，從而將有效藥物成分輸送至癌癥細胞中，造成siPlk1沉默，達到抑制細胞增殖的作用，控制腫瘤生長。

綜上所述，通過PEG化規(guī)避和蛋白互相發(fā)生作用，避免受到免疫系統(tǒng)的清除，能夠大量聚集在腫瘤位置，實現(xiàn)靶向治療，對腫瘤細胞生長起到抑制作用。納米顆粒聚集在腫瘤位置后，納米顆粒克服PEG表面修飾，能夠促進腫瘤細胞攝取納米顆粒，達到良好的抑制作用，提高藥物療效。

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收稿日期：2020-03-06

作者簡介：左佑，男，河南許昌人，本科，研究方向：高分子siRNA 納米藥物的制備及腦膠質(zhì)瘤治療。