醫院感染分子生物學研究方法進展

邵宜波 顧有為 李旭

[摘要] 為建立合理的感染控制措施，醫院感染病原菌流行病學調查非常重要。本文闡述了在醫院感染領域運用分子流行病學調查方法的進展，并列舉了其在醫院感染暴發流行病調查中的應用。分子生物學方法主要包括兩類：DNA檢測技術，如擴增片段長度多態性分析、質粒指紋圖譜分析、聚合酶鏈式反應、脈沖場凝膠電泳技術、DNA測序技術等;蛋白質檢測技術，如多位點酶電泳法、免疫印跡技術。各種方法均有優缺點，實際操作中選用何種分型方法，應根據情況來選擇。合理的分子流行病學分型方法的使用對醫院感染控制工作非常重要。

[關鍵詞] 醫院感染;流行病學分型;分子生物學;進展

[中圖分類號] R181? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）07（c）-0038-04

The progress in research methods in molecular biology of nosocomial infection

SHAO Yibo? ?GU Youwei? ?LI Xu

Department of Infection Management， the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University， Anhui Province， Hefei? ?230022， China

[Abstract] The epidemiological investigation of nosocomial infection pathogens is crucial to establish reasonable infection control measures. In this paper， the progress of molecular biological methods in the epidemiological investigation of nosocomial infection pathogens is described， and the application of some molecular biological methods in the epidemiological investigation of nosocomial infection outbreaks is listed. These molecular typing methods can be categorized into two main groups： DNA-based methods， such as amplified fragment length polymorphism， plasmid fingerprinting， polymerase chain reaction， pulsed field gel electrophoresis and DNA sequencing technology; protein-based methods， such as mutilocus enzyme electrophoresis and immunoblotting. Both kinds of methods have advantages and disadvantages. Therefore， which typing method is employed in practice should be selected based on the situation. It is very important for nosocomial infections to use a reasonable molecular biological typing method.

[Key words] Nosocomial infection; Epidemiologic typing; Molecular biology; Progress

醫院感染具有明顯的致死與致殘率非常高的特點，已經成為住院患者健康及患者預后的最大影響因素。醫院感染的發生與各種微生物都有關，其中最為常見的是細菌。近年來感染控制領域難題及焦點是多重耐藥菌的感染，為提供有效的感染控制措施，醫院感染流行病學調查非常重要，這就需要了解病原菌在醫院內的親緣關系和分布。我們通常采用各種分型技術來確定病原菌的親緣性，其中傳統分型法如細菌素、噬菌體和血清學分型等，這些分型法雖然有用，但容易受多種因素的影響，有很大的變異性，其重復性不佳，工作時間長，工作量也大，不利于醫院感染的監控。目前采用核酸技術分析醫院感染發生、發展規律，能更加精準高效地完成醫院感染的管理控制，已經成為國際醫院感染管理研究中的重要方向。近年來，隨著分子生物學技術在實驗診斷中的廣泛應用，分子生物學方法在醫院感染的暴發事件定性判定、醫院感染的引發病原菌定型判定、醫院感染的溯源等方面發揮日益顯著的作用[1-2]。

目前，在預防醫學、醫院感染的預防控制、細菌流行病學等領域已廣泛采用分子基因分型技術，如脈沖場凝膠電泳技術、多位點序列分型技術、限制性內切酶技術、質粒指紋圖譜分析方法等。而使用合理的分子生物學分型方法，對醫院感染工作非常重要。本文就醫院感染常用的分型方法展開綜述，重點闡述各種方法的原理和最新研究進展，并對其應用情況和優缺點進行討論。

1 DNA檢測技術

決定一切生物物種最基本的因子就是DNA分子上的功能片段——基因，它是遺傳信息的基本單位，醫院感染流行病學分析的重要方法之一是DNA檢測技術，它不需要特殊儀器、設備，操作簡單，節省時間，穩定性和可重復性較高，可以廣泛用于病原體分型。DNA檢測的圖譜具有高度特異性，可以從基因水平來進行分型，可將不同菌株區分開來。缺點是受核酸酶消化、提取技術及電泳條件等影響，難以統一標準。

1.1 擴增片段長度多態性（AFLP）分析

作為一種新的分子標記技術——AFLP技術，該技術已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構建、基因定位以及生物進化和分類的研究。通過聚合酶鏈式反應（PCR）技術擴增基因組DNA特定片段，先用限制性內切酶切割基因組DNA，然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點序列作為引物結合位點進行多態性分析。AFLP結合了限制性片段長度多態性（RFLP）和PCR技術高效性和穩定性的優點，擴增出現特定的DNA條帶可以作為一種分子標記，即引物誘導及DNA擴增后得到的多態DNA。由于基因組的序列差異及酶切時產生的片段長度、大小不完全相同，不同菌株之間的差異通過擴增便能顯示出來，圖譜上表現為多種條帶圖形?？勺鳛椴煌瑢嶒炇抑g的標準比較[3-4]。另外AFLP產量多，時間效率高，對細菌的分型和鑒定的操作重復性較強，因此，在調查公共衛生流行病學時更有代表性和權威性。然而，AFLP依賴昂貴的儀器設備與耗材，阻礙了AFLP的普及應用。

1.2 質粒指紋圖譜分析

質粒含有多種耐藥基因，是位于細菌染色體外的遺傳物質。質粒分析的基本原理是根據質粒DNA電泳條帶所構成的特異性圖譜對質粒進行指紋圖譜分析，適用于許多細菌，有助于醫院感染流行病學原因調查分析。目前質粒分析方法已簡化，費用已降低，具體步驟是將細菌質粒提取進行常規凝膠電泳，用限制性核酸內切酶如EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ切割細菌質粒，再分析切割出的片段長度和數目，提高細菌的鑒別能力。該方法具有諸多特點和優點，優點是實驗操作難度較低、實驗耗時較短、實驗經費開銷較小;該方法的缺陷在于部分細菌不含質粒、部分細菌的質粒會自發丟失，基因重排會改變酶切酶譜[5]。

1.3 PCR

PCR由于實驗時間短且操作過程簡便，被廣泛應用。PCR一般用限制性核酸內切酶消化PCR產物后通過電泳方法來分析結果。目前在實驗室應用比較成熟的以PCR為基礎的方法主要有以下三種：隨機引物PCR（AP-PCR）、tRNA-PCR和rep-PCR。AP-PCR是將目的DNA用一段短序列隨機擴增一些片段，根據這些片段來進行病原體分型。tRNA-PCR是使用tRNA基因作為引物來擴增目的病原體的DNA。rep-PCR是由于細菌基因組中廣泛分布著短重復序列，即基因外重復回文序列（REP），通過擴增這些系列來獲得菌株特異性圖譜[6]。但這三種方法也有其局限性，AP-PCR重復性較低，tRNA-PCR鑒別力較差，rep-PCR引物較長，因此需要較高的退火溫度。Percin等[7]通過rep-PCR將多黏菌素耐藥鮑曼不動桿菌分為三個不同的克隆型。Senok等[8]使用rep-PCR技術研究鮑曼不動桿菌造成的醫院流行暴發。相比傳統PCR技術，rep-PCR優點明確：轉化效率高、時間效率高、DNA需要量較小，可用于耐藥基因的檢測[9-10]。

1.4 脈沖場凝膠電泳（PFGE）

1984年Schwartz等[11]第一次使用PFGE技術成功分離釀酒酵母染色體DNA。作為細菌分子流行病學分型的“金標準”，PFGE技術具有分辨率高、實驗重復性好等優點，是一種被普遍適用的分子檢測技術，在細菌及真菌的分型上，顯示出較好的鑒別力和重復性。在常規凝膠電泳的基礎上，PFGE通過不斷變化電場強度，使大片段DNA分子加速溶解。用低頻裂解限制性核酸內切酶把目標染色體DNA（細菌或真菌）切成多個大小不等的片段，然后進行電泳分析。其特點是對樣品需求量小，操作方便，費時少，分辨率、靈敏度較高。一般情況下，PFGE圖譜在細菌的暴發流行株間相似，容易判斷[12-13]。但是一旦染色體發生變異事件，如DNA缺失、插入或點突變時，其圖譜條帶就有相應改變。目前，PFGE已成功應用于細菌的流行病學研究[14-17]。但是，PFGE圖譜分析，花費時間長，過程細節多，操作步驟與操作人員技術高低有關，如果圖譜結果不一致，就會對實驗室結果之間的比較產生影響，且實驗周期長，使用的儀器及材料較多、較貴。目前已出現了第二代快速的PFGE方法進行基因分型，這無疑對PFGE起到積極的推動作用。

1.5 DNA測序技術

隨著DNA測序方法的改進，細菌分子分型技術也日益成熟，其中下述兩種DNA測序技術發展較快。

1.5.1 多位點序列分型（MLST）? MLST主要基于核酸序列測定，它已成為細菌的常規分型方法。通過PCR擴增多個管家基因內部片段來測定其序列，可以在全球不同實驗室之間分析比較不同菌株的差異。優點是更加快速和準確、適合流行病學調查，由于可以快速比較分析細菌的流行病學和進化研究方面數據結果，更有利于臨床及時采取有效的控制措施[18]。國內學者最近也用該方法來研究屎腸球菌和糞腸球菌等具有耐藥特性菌株的遺傳背景[19]。該方法通過PCR擴增測序分析不同的管家基因內部片段序列型（ST），然后通過比較ST對細菌進行分型。MLST可通過研究管家基因與參考菌株的相應序列構建進化樹來判斷菌種歸屬，可以用于菌株的鑒定及變異[20]。有人用PFGE和MLST方法對單核細胞增生李斯特菌開展了分型方面的研究[21]。Mezzatesta等[22]研究鮑曼不動桿菌時發現，MLST和PFGE在分辨力和可重復性方面是相同的，該技術可直接分析臨床標本，操作簡便、實用型強，數據可實現網絡共享，越來越多地被作為進行國際間菌株比較的常用工具、進行生物進化和種群結構的研究。但該技術的不足之處是必須事先掌握待檢測微生物的基因組序列，才能推測出該微生物的決定基因，因該方法對DNA測序的依賴程度太高且實驗費用較昂貴，制約了其應用范圍。

1.5.2 高通量測序技術（深度測序技術）? 該技術的誕生是基因組學研究領域的一個里程碑，使一個物種的轉錄組和基因組序列全面分析成為可能，所以又被稱為深度測序。與第一代測序技術相比，該技術極大降低了核酸測序單堿基的成本。以人類基因組測序為例，20世紀末進行的人類基因組計劃花費30億美元解碼了人類生命密碼，而第二代測序使人類基因組測序進入萬（美）元基因組時代。降低的單堿基測序成本可以揭示更多生物物種的基因組遺傳密碼。同時在已完成基因組序列測定的物種中，對其大規模的全基因組重測序也成為現實。它具有檢測速度快、全面、錯誤少及數量大等特點，相對于傳統測序技術，高通量測序技術測定序列量大，可以一次對多達幾百萬條DNA分子同時進行序列測定[23-24]，可見其對時代變化的影響。有研究表明[25-26]，該技術對微生物多樣性分析研究效果較好。雖然測序速度快，但測序所需儀器價格較高，且對大數據的分析處理過程復雜，因此不適合小規模測序。

2 蛋白質檢測技術

2.1 多位點酶電泳法

多位點酶電泳法又稱同工酶電泳法，可用于病原體分型，對臨床細菌具有一定的分型能力，原理是根據在凝膠中的蛋白質電泳遷移率不同來進行分型，而電泳遷移率不同是由于氨基酸不同造成的，將蛋白電泳后結果與標準結果來進行分型比較。應用在分子流行病學和遺傳學方面，比傳統的細菌分類學方法具有更多的優勢，可以分辨出被檢測的所有菌株的型別，解釋菌株的群體遺傳差異及兩菌株的遺傳距離等。從實驗過程來說，此操作流程比較簡單，不需要特殊的儀器，PCR探針雜交等技術成本便宜，適宜于基層單位推廣應用。盡管如此，作為一種方法，多位點酶電泳法還是有它的局限性，譬如有的病原體不含有某一同工酶，另外，很多的因素可以影響實驗結果。

2.2 免疫印跡技術

免疫印跡法又稱蛋白質印跡法，它是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術?？梢酝ㄟ^特異性抗原抗體反應來檢測某種蛋白是否存在于樣品中。其具有高分辨力、高特異性、強敏感性的優點，已成為檢測蛋白質表達與分布特性最有效且最常規的技術[27]。目前在醫院感染的流行病學分析方面取得一定的效果，其操作是將電泳后的細菌蛋白轉移到硝酸纖維膜上，與相應的抗體反應后，用酶標第二抗體來測定目標細菌的抗原。但該技術缺點是轉移過程容易出現大量干擾條帶，同時易受操作者提取技術和細菌自身環境影響。

3 小結

通過對各種類型方法的綜述，不同類型的分型技術具有各自的長處和短處。實際操作中選用何種分型方法，應參照指標與需求來選取。既要考慮到分辨能力又要考慮到實驗的重復性，同時要綜合實驗成本、實驗室資源以及實驗者本身的操作技能和知識水平。

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（收稿日期：2020-03-10）