OSMAC 方法在微生物次級代謝產(chǎn)物研究中的應(yīng)用

朱美林 王皓天

（蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠233000）

1 概述

微生物次生代謝物已被認(rèn)為是藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)中新化合物的主要來源。傳統(tǒng)的微生物化學(xué)研究主要集中在從發(fā)酵液和菌絲體中提取和分離具有結(jié)構(gòu)活性的化合物。然而，由于已知次生代謝物的高重新發(fā)現(xiàn)率，這些過程正變得低效[1]。人們普遍認(rèn)為，在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵條件下，很大一部分微生物基因簇是沉默的。通過挖掘微生物基因組和針對次生代謝物的生物合成基因簇，研究人員可以更客觀地挖掘微生物的潛力，如擊倒、引入或異源表達(dá)微生物基因，調(diào)節(jié)啟動子，誘導(dǎo)突變，或改變培養(yǎng)條件來刺激次生代謝物基因的表達(dá)[2]，見圖1。改變培養(yǎng)條件被認(rèn)為是最簡單、最有效的策略，被Zeeck 教授和他的同事稱為"一株多化合物(OSMAC)"[3]。在廣泛查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，本文總結(jié)了應(yīng)用OSMAC 策略的重要和成功的例子，包括改變培養(yǎng)基、改變培養(yǎng)條件、與其他菌株共培養(yǎng)、添加表觀遺傳修飾劑或生物合成前體[4]。

圖1 激活微生物沉默基因簇的策略

2 OSMAC 常見方法

2.1 改變培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)方式

培養(yǎng)基不僅對微生物生長有較大影響，而且對新陳代謝也有較大影響。據(jù)報道，C/N 比、鹽度和金屬離子可以調(diào)節(jié)MSM基因表達(dá)的程度和模式，導(dǎo)致各種次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。

一株海洋來源的Asteromyces cruciatus 763 菌株在僅含精氨酸的查氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，產(chǎn)生了一種新的五肽lajollamide A（1），見圖2，而不是在正常的查氏培養(yǎng)基中缺失的NaNO3[5]。

圖2 部分代表化合物的結(jié)構(gòu)式

一株曲霉屬真菌Aspergillus sp.在富氘查氏肉湯上培養(yǎng)時，從中分離得到了6 個生物堿類化合物，而該菌株在PDB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，能代謝一種新的戊烯化吲哚生物堿waikialoid A（2），該生物堿對白色念珠菌生物膜的形成有較強(qiáng)的抑制作用，IC50值為1.4μM[6]。

在燕麥麩皮培養(yǎng)基中，一株鏈霉菌Streptomyces sp. A1 在甘露醇/豆粕培養(yǎng)基中合成了3 個已知化合物，在添加土壤的培養(yǎng)基(脫脂豆粕2%、甘露醇2%、瓊脂2%)中合成了3 個新的同系物和streptenol E（3）。Streptenol E 對HMO2、HepG2、MCF-7和Kato III 四種腫瘤細(xì)胞株有明顯的細(xì)胞抑制作用，GI50值分別為0.15、0.3、10 和0.7 μM[7]。

與海水培養(yǎng)相比，一株海洋來源的真菌Aspergillus unguis CRI282-03 CRI282-03 在KBr 培養(yǎng)基中產(chǎn)生了新的depsidones和兩種新的depsidones 衍生物（4, 5），在KI 發(fā)酵液中產(chǎn)生了一種新的地西酮（6）[8]。

同時，越來越多的證據(jù)表明，培養(yǎng)狀態(tài)可以直接影響微生物的代謝過程，包括固體或液體，靜態(tài)或動態(tài)。雜色曲霉A.versicolor ZLN-60 菌株在靜態(tài)液體條件下能產(chǎn)生2 個新的環(huán)五肽和4 個新的戊烯基二苯醚。生物學(xué)試驗(yàn)表明，化合物（7）對Hela 和K562 癌細(xì)胞具有中等的細(xì)胞毒作用，IC50值分別為31.5和48.9μM。然而，對其固體培養(yǎng)基粗提物的進(jìn)一步純化，還檢測到了另外4 個新的環(huán)肽[9，10]。一株海洋來源的鏈霉菌Streptomyces sp. CHQ-64 菌株在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)產(chǎn)生6個新的抗真菌多元醇和2 個細(xì)胞毒性的雜合異戊二烯生物堿，而該菌株在靜態(tài)條件下只產(chǎn)生1 個新的雜合異戊二烯生物堿（8）[11]。

2.2 添加前體

生物合成前體是指一種易于直接結(jié)合到最終產(chǎn)品中的化學(xué)物質(zhì)。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加各種生物合成前體可以改變次生代謝物的生物合成途徑，從而產(chǎn)生新的化合物。用阿魏酸+奎寧酸或肉桂酸+3，4-(亞甲基二氧基)肉桂酸處理來自咖啡成熟漿果的內(nèi)生菌殼青霉，產(chǎn)生霉酚酸和5- 羥基7- 甲氧基-4- 甲基苯酞（9）。在L- 色氨酸和D- 色氨酸供應(yīng)的培養(yǎng)基中，從一株海洋來源的印度毛殼菌KLA03 中鑒定了3 個新的細(xì)胞松弛素。化合物（9）對A549 細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，IC50值為8.2 μM[12]。

2.3 添加酶抑制劑

表觀遺傳修飾劑是指那些能夠隨著表觀遺傳狀態(tài)的改變而改變微生物特性的化學(xué)物質(zhì)，如DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑和組蛋白脫乙酰化酶(HDAC)抑制劑。這些修飾劑的加入通常會抑制生物合成途徑中相關(guān)酶的活性，促進(jìn)其他代謝途徑的進(jìn)展。

5- 氮胞苷(5-AC)是一種最常用的DNMT 抑制劑，用于修飾微生物DNA 的功能，其次是抑制基因轉(zhuǎn)錄。對一株海洋來源的真菌Aspergillus sydowii 進(jìn)行化學(xué)研究，在其培養(yǎng)基中添加5-AC 時，得到了新的雙拋物烷型倍半萜類化合物（10）[13]。

組蛋白的乙酰化或去乙酰化影響其與微生物中DNA 的結(jié)合。雙羥肟酸(SBHA)、異羥肟酸(SAHA)和煙酰胺是最常用的HDAC 化學(xué)物質(zhì)，用于抑制微生物中的脫乙酰基，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

許多報道表明，培養(yǎng)基中SAHA 的存在可能導(dǎo)致新的天然化合物的產(chǎn)生，例如在SBHA 處理的培養(yǎng)基中，印度毛殼菌能產(chǎn)生2 個新的螺內(nèi)酯聚酮和6 個新的戊烯基芳香族聚酮[14]。

2.4 混合培養(yǎng)

在一種培養(yǎng)基中，一種菌株與另一種菌株之間的關(guān)系可以是競爭的、拮抗的或友好的。兩個或兩個以上菌株的共培養(yǎng)通常有提高已知化合物產(chǎn)量或積累在無菌培養(yǎng)中未檢測到的隱蔽化合物的積極作用。從喀麥隆植物中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生毛殼菌(Chaetomium sp.)，與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)時能產(chǎn)生兩個新的莽草酸類似物和四個新的丁烯內(nèi)酯衍生物，而這些化學(xué)物質(zhì)在無菌培養(yǎng)基中都不存在[15]。

在采集自巴哈馬的海鞘的內(nèi)生真菌Libertella sp. CNL-523與另一株Thalassospira sp. CNJ-328 混合培養(yǎng)產(chǎn)生了4 個新的二萜類化合物。化合物（11）對HCT-116 人腺癌細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒作用，IC50值為0.76 μM[16]。

3 結(jié)論

微生物對培養(yǎng)基成分、溫度、pH、鹽度、培養(yǎng)狀態(tài)、無菌或混合培養(yǎng)、表觀遺傳修飾劑、生物合成前體等培養(yǎng)條件敏感。這些因素的變化可能會改變次生代謝物的化學(xué)多樣性。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法僅限于表達(dá)大量代謝途徑，許多次級代謝產(chǎn)物無法生物合成。越來越多的證據(jù)表明，OSMAC 策略可以為提高次級代謝產(chǎn)物的化學(xué)多樣性提供一種簡單、快速和有效的途徑，通過激活沉默的基因簇來獲得新的藥物先導(dǎo)。如今，新次級代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)率越來越低，而重新發(fā)現(xiàn)已知化合物的可能性比以前更高。因此，OSMAC 戰(zhàn)略將是緩解這一挑戰(zhàn)的重要替代途徑。