胎兒染色體非整倍體21三體、18三體和13三體檢測試劑盒（高通量測序法）行業(yè)標準的制定

張文新 于婷 孫楠 陳樣宜 高飛 黃杰★ 曲守方★

染色體非整倍體異常是常見的遺傳病，包括21-三體綜合征（Trisomy 21，T21）、18-三體綜合征（Trisomy 18，T18）和13-三體綜合征（Trisomy 13，T13），以及一些性染色體三體型（47，XXY）及X 染色體單體型（45，X）。21-三體綜合征是新生兒最常見的染色體病，發(fā)生率約為1∶800［1］，60%患兒在胎內(nèi)早期即流產(chǎn)，存活者有明顯的智力落后和生長發(fā)育障礙等。而13-三體綜合征和18-三體綜合征患兒則伴有嚴重的畸形及生長和智力發(fā)育遲緩，多數(shù)在出生后1年內(nèi)死亡［2］。這類疾病建議通過產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷進行預防，從而降低出生缺陷發(fā)生率。傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方法是通過絨毛活檢、羊水穿刺或者臍靜脈血穿刺等，獲得胎兒的染色體進行核型分析。1997年，盧煜明［3］等在母體的血液中發(fā)現(xiàn)了胎兒游離DNA（circulating cell-free fetal DNA），幾乎全部來源于胎盤滋養(yǎng)層細胞。母體外周血游離DNA 約5%～10%為胎兒的DNA，并且隨著孕周增大胎兒游離DNA 含量也隨之增加，分娩后2 小時即被清除，成為妊娠的特異性標志。基于這一研究，無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測（Non-invasive prenatal genetic testing，NIPT）技術(shù)為胎兒染色體非整倍體檢測開辟新的研究方向，它是采用二代測序技術(shù)（Next-generation sequencing technology）并結(jié)合生物信息學分析胎兒發(fā)生染色體非整倍體的風險率［4］，已經(jīng)應用于臨床檢測。

目前我國尚無相關的國家標準或者行業(yè)標準對該類試劑盒的性能和使用進行規(guī)范，亟需制定其行業(yè)標準對試劑盒的性能進行評價。行業(yè)標準的制定將有助于提高并統(tǒng)一產(chǎn)品標準。本研究是使用國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）批準的基于二代測序技術(shù)的胎兒染色體非整倍體（T13/T18/T21）檢測試劑盒，對高通量測序用外周血胎兒染色體非整倍體（T21、T18 和T13）國家參考品進行檢測，評價該標準的可行性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

高通量測序用外周血胎兒染色體非整倍體（T21、T18 和T13）國家參考品，中國食品藥品檢定研究院（簡稱中檢院）提供。

胎兒染色體非整倍體（T13/T18/T21）檢測試劑盒（可逆末端終止測序法）和NextSeq CN500 基因測序儀，杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司提供。胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測試劑盒（聯(lián)合探針錨定聚合測序法）和BGISEQ-500基因測序儀，華大生物科技（武漢）有限公司提供。胎兒染色體非整倍體21 三體、18 三體和13 三體檢測試劑盒（半導體測序法）和DA8600 基因測序儀，廣州市達瑞生物技術(shù)股份有限公司提供。胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測試劑盒（半導體測序法）和BioelectronSeq 4000 基因測序儀，東莞博奧木華基因科技有限公司提供。

1.2 血漿游離DNA 提取

采用試劑盒說明書指定的血漿游離DNA 提取試劑盒（磁珠法）或者核酸提取或純化試劑，提取國家參考品的血漿游離DNA。

1.3 文庫的制備

采用四家胎兒染色體非整倍體（T13/T18/T21）檢測試劑盒，對血漿游離DNA 進行文庫構(gòu)建。以半導體測序法試劑盒為例，先將血漿游離DNA 片段末端修復，進行目標DNA 片段的富集，然后在DNA 片段兩端分別加入與測序芯片結(jié)合的接頭連接和區(qū)分樣本的唯一性的標簽序列，PCR 擴增后用DNA 純化試劑盒進行純化，獲得待測序分析的文庫。使用熒光定量PCR 儀測定各個文庫的濃度，按照等物質(zhì)的量混合文庫。

1.4 測序

將一定量的混合文庫，加到測序芯片上，用基因測序儀檢測。以BioelectronSeq 4000 基因測序儀為例，將帶有測序接頭的DNA 文庫加入乳液擴增反應體系，使每個DNA 模板在獨立的微擴增環(huán)境中擴增放大，然后其作為測序模板載入測序芯片。將四種脫氧核苷酸分別標記不同的熒光基團，每一個循環(huán)添加一種核苷酸，該核苷酸如果被合成到DNA 中會釋放氫離子，引起溶液PH 值變化從而得到核苷酸序列信息。

1.5 數(shù)據(jù)分析

測序完成后通過生物信息軟件，對獲得的fastq 數(shù)據(jù)進行過濾。使用BWA 軟件，將每個read與人類基因組參考序列進行比對，計算出唯一比對到基因組每條染色體上的read 數(shù)，并獲得每條染色體上read 數(shù)占全部染色體的百分比。使用Z值公式分別計算待分析樣本的21 號、18 號和13 號染色體的Z 值，Z 值大于3.0 的樣本判定為相應染色體三體陽性。

2 結(jié)果

2.1 建庫質(zhì)量和有效數(shù)據(jù)量

行業(yè)標準的建庫質(zhì)量，要求在檢測國家參考品或企業(yè)參考品時，應規(guī)定明確的文庫構(gòu)建失敗率。采用國家參考品檢測時，要求文庫構(gòu)建失敗率應不超過1.0%，即227 個樣本不超過2 個樣本失敗。經(jīng)過四家不同試劑盒的驗證，結(jié)果表明只有1家公司的2 批試劑的文庫構(gòu)建失敗率為0.88%和0.44%，其余均為0%，符合標準要求。

標準要求對國家參考品或企業(yè)參考品中數(shù)據(jù)量控制參考品，應有明確的數(shù)據(jù)量要求。國家參考品要求數(shù)據(jù)量控制參考品（1-BAC、2-BAC、3-BAC 和4-BAC）的有效數(shù)據(jù)量應不低于3.5 M（1M 代表1，000，000 條reads）。經(jīng)過A、B、C 和D四家不同試劑盒的驗證，每個參考品重復3 次試驗，結(jié)果表明均符合要求，見圖1。

圖1 數(shù)據(jù)量控制參考品結(jié)果Figure 1 Result of data volume reference

2.2 陽性參考品符合率

標準要求采用國家參考品或企業(yè)參考品中陽性參考品進行檢測，結(jié)果應為相應的胎兒染色體非整倍體（21 三體、18 三體和13 三體）。分析胎兒游離DNA 濃度為10%的T21、T18 和T13 國家陽性參考品的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示均為相應染色體三體，且與樣本的染色體核型結(jié)果一致。其中標示為21-T21-17-10%的國家陽性參考品結(jié)果為21 三體高風險（Z=10.159），同時提示13 三體低風險（Z=-0.824）和18 三體低風險（Z=0.736），見圖2。

圖2 陽性參考品21 號染色體的結(jié)果Figure 2 Result of chromosome 21 for positive reference

2.3 陰性參考品符合率

標準要求采用國家參考品（染色體正常樣本和其他類型染色體非整倍體）或企業(yè)參考品中陰性參考品進行檢測，結(jié)果應為21 三體、18 三體和13 三體陰性。分析胎兒游離DNA 濃度為10%國家陰性參考品的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示均未檢出21 三體、18 三體和13 三體。標示為187-T22-1-10%陰性參考品結(jié)果為21 三體低風險（Z=0.908）、18 三體低風險（Z=-0.023）和13 三體低風險（Z=0.383），而22 三體高風險（Z=14.459），其結(jié)果與該樣本的染色體核型結(jié)果一致，見圖3。

圖3 陰性參考品22 號染色體的結(jié)果Figure 3 Result of chromosome 22 for negative reference

2.4 檢測限

標準要求采用國家參考品或企業(yè)參考品中檢測限參考品進行檢測，對5%濃度檢測限參考品應全部檢出，對3.5%濃度檢測限參考品檢出率應不低于50%。分析胎兒游離DNA 濃度為5%和3.5%國家檢測限參考品的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示均能正確檢出相應染色體三體。標示為101-T13-7-5%的5%濃度檢測限參考品結(jié)果為13 三體高風險（Z=10.819）、18 三體低風險（Z=-1.326）和21 三體低風險（Z=0.458），標示為147-T13-3-3.5%的3.5%濃度檢測限參考品結(jié)果為13 三體高風險（Z=8.067）、18三體低風險（Z=-2.221）和21 三體低風險（Z=-0.102），見圖4。結(jié)果表明不低于3.5%胎兒DNA濃度染色體非整倍體樣本能夠正確檢出。

圖4 5%濃度和3.5%濃度的檢測限參考品13 號染色體的結(jié)果Figure 4 Result of chromosome 13 for 5%and 3.5%limit reference

2.5 微缺失微重復參考品符合率

標準要求采用國家參考品或企業(yè)參考品中微缺失微重復參考品進行檢測，微缺失微重復參考品中18、13、21 號染色體中一定片段大小以上微重復樣本應全部檢出相應拷貝數(shù)變異，其他染色體微缺失微重復參考品檢測結(jié)果不應為21 三體陽性、18 三體陽性和13 三體陽性。微缺失微重復國家參考品包括2 個18 號染色體含20 Mb 以上微重復的參考品，結(jié)果顯示全部檢出18 三體高風險（Z=4.601 和4.798），同時13 三體低風險（Z=-1.154和0.932）和21 三體低風險（Z=-1.265 和-1.373）；而其他8 個微缺失微重復參考品結(jié)果均未檢出21三體、18 三體和13 三體。見圖5。

圖5 微重復參考品18 號染色體的結(jié)果Figure 5 Result of chromosome 18 for microduplication reference

2.6 嵌合體參考品符合率

標準要求采用國家參考品或企業(yè)參考品中嵌合體參考品進行檢測，對規(guī)定百分比以上的異常嵌合體參考品應全部檢出，低于規(guī)定百分比的異常嵌合體參考品可為檢出或未檢出。分析嵌合比例為70%和30%的國家嵌合體參考品的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示為相應染色體三體，表明該試劑盒也能準確檢測出嵌合體樣本。標示為158-T21-M-70%嵌合體參考品的結(jié)果為21 三體高風險（Z=14.275）、13 三體低風險（Z=-1.508）和18 三體低風險（Z=0.866），標示為161-T21-M-30%嵌合體參考品的結(jié)果為21 三體高風險（Z=6.353）、13 三體低風險（Z=-2.155）和18 三體低風險（Z=-0.716），見圖6。

圖6 嵌合體參考品21 號染色體的結(jié)果Figure 6 Result of chromosome 21 for chimera reference

3 討論

無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測在臨床上已經(jīng)應用于胎兒染色體非整倍體（T21、T18 和T13）的檢測［5-6］，它只需采集孕婦靜脈血從中提取胎兒游離DNA，具有無創(chuàng)性、高通量和高準確性等優(yōu)點，為胎兒染色體非整倍體疾病的產(chǎn)前輔助診斷提供新的檢測技術(shù)。但是該技術(shù)也有一定的局限性，對三體平衡易位和嵌合型三體的檢出率低，不能特異性地檢測出嵌合體異常等干擾因素的影響，而且限制性胎盤鑲嵌體（confined placental mosaicism，CPM）對性染色體異常檢測有較多的假陽性等影響［7-8］。因此染色體核型分析技術(shù)仍是染色體非整倍體診斷的金標準，無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測結(jié)果陽性需要進行染色體核型分析作為最終診斷。

2014年國家食品藥品監(jiān)督管理總局要求遺傳性疾病預測的產(chǎn)前基因檢測儀器、試劑和醫(yī)用軟件等產(chǎn)品需要經(jīng)食品藥品監(jiān)管部門審批注冊，并經(jīng)衛(wèi)生計生行政部門批準方可應用。為完成基于第二代測序技術(shù)的胎兒染色體非整倍體（T13/T18/T21）檢測試劑盒的注冊檢驗工作，中檢院研制高通量測序用外周血胎兒染色體非整倍體（T21、T18 和T13）國家參考品。2018年中檢院負責制定胎兒染色體非整倍體21 三體、18 三體和13 三體檢測試劑盒（高通量測序法）行業(yè)標準。人群中胎兒DNA 濃度分布的統(tǒng)計結(jié)果表明有接近一半樣本中胎兒DNA 濃度大于10%，超過96%樣本中胎兒DNA 濃度高于4%，NIPT 協(xié)議建議使用4%作為較低的胎源DNA 含量臨界值［9］。標準的檢測限要求胎兒DNA 濃度5%的陽性參考品必須檢出，同時要求胎兒DNA 濃度3.5%的陽性參考品必須有50%以上的檢出比例。為了模擬胎兒嵌合體異常情況，在國家參考品中設置嵌合比例分別為70%和30%的T21、T18 和T13 嵌合體參考品，標準要求70%嵌合體參考品必須檢出。中檢院采用不同測序平臺的試劑盒對國家參考品進行檢驗，結(jié)果顯示均符合行業(yè)標準的要求，表明制定的胎兒染色體非整倍體21 三體、18 三體和13 三體檢測試劑盒（高通量測序法）行業(yè)標準具有很好的適用性，可以用于試劑盒的質(zhì)量評價和上市后的監(jiān)督管理工作。