天蠶素抗菌肽B在魚類疾病控制中的應用

羅陽瑞，王 晗，代奉林，黃紅云，樊汶樵，姜玉松，李曉英

(重慶文理學院林學與生命科學學院 重慶文理學院水生動物疫病防控研究所，重慶 永川 402168)

抗菌肽是分子質量小、兩親性、帶正電的非特異性物質[1-2]，多為α螺旋結構，天蠶素是最早被發現的，目前研究最清晰，效果最顯著的一類抗菌肽。早在1972年，瑞典科學家Boman等[3]從美國希古比天蠶蛹(Hyalophoracecropia)中獲得抗菌肽，并將其命名為Cecropin；隨后，Boman等測定了天蠶素抗菌肽A (Cecropin A) 和天蠶素抗菌肽B (Cecropin B)的一級結構[4]。目前，天蠶素抗菌肽家族已被分為A、B、C、D、E共5個成員，其中Cecropin B具有最高的抗菌活性[5-6]。

魚類是較低等的脊椎動物，缺乏完善的免疫系統來抵抗微生物的侵襲，其皮膚、黏膜存在的免疫活性因子在主動防御中發揮著重要作用[7]。抗菌肽是魚類自身先天免疫的重要組成成分，研究抗菌肽在魚類中的應用，不僅為預防魚類病害開辟新途徑，還能拓展抗菌肽在漁業生產中潛在的應用領域。天蠶素抗菌肽B抗菌譜廣，對多種細菌性疾病有很強抗性[8]，對不同種類的病毒也有抵御作用，使其在水產行業有很好的應用前景。

1 Cecropin B的結構與作用機理

Cecropin B是最早從希古比天蠶中分離得到，由35個L-氨基酸殘基組成的抗菌肽，其序列為KWKIFKKIEKVGRNIRNGIIKAGPAVAVLGEAKAL[9]，分子量約4 kDa。Hu等[10]認為天蠶素抗菌肽B具有兩親性的α螺旋結構，N端形成親水性的α螺旋結構，C端形成疏水性的α螺旋結構且酰胺化[11]。Srisailam等[12]用NMR(核磁共振)測定Cecropin B1的結構(圖1)，發現其N端堿性很強，帶正電荷，親水，富含賴氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)，N端氨基酸序列比C端對于其活性具有更重要的作用；如N端第2位上的色氨酸，因色氨酸上有苯環，會影響其活性；天蠶素抗菌肽B一般不含半胱氨酸(Cys)，所以不能形成分子內的二硫鍵[11-13]。

圖1 Cecropin B1的結構示意圖[12]A：N-末端α-螺旋; B：鉸鏈區; C：C-末端α-螺旋

Cecropin B帶正電，與細菌接觸時通過靜電作用，吸附于細菌表面，先破壞細菌細胞壁結構，使大量的Cecropin B選擇性的堆積在細胞膜脂質表面，達到一定濃度時，因為其C端疏水性強，插入細菌胞膜，造成膜缺陷或形成“孔隙”，改變細胞通透性，使細菌內容物大量外流，最終導致細菌死亡[14-16]。其作用機制如中插彩版圖2所示。

2 Cecropin B在細菌病中的應用

引起魚類疾病的致病菌繁多，主要歸屬于氣單胞菌屬(Aeromonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、維氏氣單胞菌(A.veronii)、殺鮭氣單胞菌(A.salmonicida)、鰻弧菌(Vibrioanguillarum)等。氣單胞菌會引起淡水魚細菌性敗血病、細菌性腸炎、癤瘡等，假單胞菌屬主要危害鯉魚、草魚等，能引起草魚100%的死亡。Sarmasik A等[17]報道重組的Cecropin B和Cecropin P1單細胞克隆入大鱗大麻哈魚(Oncorhynchustshawytscha)胚胎細胞中，表達出的雜合天蠶素抗菌肽對嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)等病原菌有很強的抑菌效果；盧強等[18]將綠色熒光蛋白(GFP)基因與Cecropin B突變體ABP-S1基因進行融合表達，發現對銅綠假單胞菌(P.Aeruginosa)、嗜水氣單胞菌等多種病原菌有抑菌效果；王自蕊等[19]向湘云鯽的鰭部注射0.5 mL嗜水氣單胞菌活菌液后，發現添加Cecropin B組比對照組的存活率更高。林鑫等[20]在感染維氏氣單胞菌的魚類中添加Cecropin B，10 d后，錦鯉的累積死亡率顯著降低；Kjuul等[21]研究發現，Cecropin B對魚的殺鮭氣單胞菌、鰻弧菌、鮭弧菌等多種病原菌都有抑制作用，還發現隨著氯化鈉鹽濃度的升高，Cecropin B的活性會明顯降低；Sallum等[22]用鰻弧菌、嗜鹽弧菌(Vibriohalophilus)和耶爾森菌(Yersinia)感染青鳉魚時，發現Cecropin B的表達量會持續升高，增強青鳉魚的抵抗力，且這3種誘導產生的抗性與它們超微結構的可逆變化相關。Lin X等[23]將天蠶素抗菌肽加入到雜交羅非魚日常飼料中，研究發現，與未添加相比，添加組在生長性能、非特異性免疫能力及對維氏氣單胞菌的抗感染能力方面均有提高。Elaswad A[24]將Cecropin B的基因轉移到鯰魚魚種中，用多毛魚虱(Ichthyophthiriusmultifiliis)這種寄生蟲去感染后，發現轉基因鯰魚存活率比普通魚高；Bugg W[25]將Cecropin B的基因轉移到斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)形成轉基因魚，用柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcolumnare)和愛德華菌(Edwardsiellaictaluri)去感染，發現轉基因魚存活率都要高于普通魚。一系列的報道表明，Cecropin B在魚類抗細菌感染中發揮著重要的作用。

3 Cecropin B在病毒病中的應用

病毒性疾病會嚴重危害魚類的生長，甚至導致死亡。目前關于Cecropin B對魚類病毒性疾病的研究較少。Lo J H等[26]發現合成肽Cecropin B和模擬Cecropin B結構的模擬肽CF17，能明顯抑制感染性造血壞死病毒(IHNV)、病毒性出血性敗血病病毒(VHSV)、蛇頭棒病毒(SHRV)和感染性胰腺壞死病毒(IPNV)等重要魚類病毒性病原對機體的侵襲。2014年，Chiou P P等[27]人工合成Cecropin B基因并構建CF-17轉基因載體后，植入虹鱒魚精子，隨后用IHNV感染轉基因與非轉基因的虹鱒，發現CF-17轉基因親本魚對IHNV的感染具有顯著的抗性；Chia等[28]發現Cecropin B對致海洋魚類在幼年期大規模死亡的神經壞死病毒(NNV)有較強的抑制作用。

4 展望

Cecropin B抗菌譜廣，對魚類多種細菌性病原體有不同程度的抑制或殺傷作用；鑒于天蠶素抗菌肽結構中沒有二硫鍵，重組表達中不涉及二硫鍵的重構，且鮮有Cecropin B產生耐藥性的報道，證實了Cecropin B成為新型抗生素替代品的潛力。然而從希古比天蠶蛹或其他動物中提取的Cecropin B含量很少，目前一般采取人工合成的方式獲取該抗菌肽；但人工合成抗菌肽價格高昂還容易降解，影響了Cecropin B在生產中的廣泛應用。在具體的研究中，針對重組Cecropin B外源蛋白表達量低、穩定性差等問題，研究者多將2個及以上的目的基因進行串聯表達，取得了較好的進展[29]。隨著基因重組和表達技術的不斷進步，大量獲得外源性Cecropin B逐漸成為現實，Cecropin B必將在實際生產中得到更為廣泛的應用。