運(yùn)用逆流技術(shù)高效提取紫薯花青素

張瓊月，李冰寒， 李林輝

（西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川南充 637009）

花青素是一類水溶性較好的植物源性類黃酮類色素[1-2]，通常分布在多種顏色較深的水果、蔬菜細(xì)胞組織之中，參與植物花和果實(shí)顏色的決定[3-4]，如葡萄、黑枸杞、藍(lán)莓、紫甘薯、桑葚等。目前的研究已知，花青素不僅具有較強(qiáng)的抗氧化和清除人體自由基的能力，還有良好的防治癌癥、增強(qiáng)記憶、改善視力、控制體重、心血管保護(hù)等作用，在食品、藥品、保健和美容等行業(yè)均有應(yīng)用[5-11]。

紫薯（Solanum tuberdsm） 又叫紫甘薯、黑薯，因其薯肉呈紫色或深紫色而得名。除了具備普通紅薯所含的營養(yǎng)成分外，還富含硒元素和花青素[12]。花青素分布在紫薯的塊根和莖葉中，尤其在塊根中含量豐富，所以紫薯塊根是工業(yè)提取花青素的主要原料之一[13]。目前，提取紫薯花青素有多種方式[14]。王兆雨等人[15]運(yùn)用直接浸提法，提取條件為體積分?jǐn)?shù)50%乙醇提取劑、50 ℃恒溫水浴60 min，pH 值3.5，此時(shí)花青素的提取率為5.8%。Sun Y Z 等人[16]運(yùn)用微波提取法，通過響應(yīng)面法確定最優(yōu)工藝為鹽酸乙醇提取紫薯花青素，料液比1∶5，在71 ℃下提取53 min，花青素含量為363.90 μg/g。回晶等人[17]運(yùn)用超聲波輔助提取法，將鹽酸乙醇作為提取液，料液比1∶40，50 ℃恒溫提取25 min，最終得到的花青素為324.87 μg/g。但這些方法效率并非很高。

動(dòng)態(tài)逆流提取[18]，即將提取溶劑和待提取物料分別從設(shè)備兩端連續(xù)加入，待提取物料向出渣口方向逐級(jí)向后移動(dòng)，最后作為殘?jiān)懦谶@個(gè)移動(dòng)過程中，待提取物料中的有效成分濃度越來越低，而用于提取待提取物料中有效成分的提取溶劑從出渣口一側(cè)加入，逐級(jí)向前移動(dòng)，隨著提取劑的逐級(jí)向前移動(dòng)，存在于提取劑中的有效提取物濃度越來越高，直到從第一級(jí)流出。動(dòng)態(tài)逆流提取的級(jí)數(shù)依據(jù)二者間的反應(yīng)效率來定，理論上級(jí)數(shù)越多，提取量越多，但在實(shí)際生產(chǎn)中，還需考慮再增加提取級(jí)數(shù)是否還具有經(jīng)濟(jì)效益，如果增加了級(jí)數(shù)，不再產(chǎn)生更多的效益，那就不再增加。

逆流提取方法在中藥活性成分的工業(yè)提取上獲得了廣泛應(yīng)用[19-25]，從枸杞、姜黃、甘草、茶樹紫芽、赤靈芝等眾多中藥材中提取活性物質(zhì)的研究均有報(bào)道，但尚未見其應(yīng)用于紫薯花青素的提取研究中。以新鮮紫薯為原料，利用逆流提取技術(shù)進(jìn)行紫薯花青素提取工藝的研究，并獲得了較為理想的效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綿紫薯9 號(hào)塊莖，實(shí)驗(yàn)室栽培所得。

莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)品，購于索萊寶公司；無水乙醇、鹽酸，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫薯預(yù)處理

選取大小均勻、質(zhì)量相近、表皮無明顯破損的新鮮紫薯洗凈，室溫下晾干表面水分，切成薄片，于60 ℃下烘干至恒質(zhì)量，研磨成粉，過50 目篩，密封后4 ℃下避光保存[26]。

1.2.2 逆流提取級(jí)數(shù)的設(shè)定

在正式試驗(yàn)開始前，對(duì)樣品粉末進(jìn)行重復(fù)靜置提取，并分別測定提取液中的花青素含量，以此對(duì)逆流提取的最佳級(jí)數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。參考畢云楓等人[27]的研究結(jié)果設(shè)置試驗(yàn)條件，對(duì)樣品進(jìn)行重復(fù)靜置提取試驗(yàn)。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果如下：第1 次提取所得濾液中的花青素含量為0.288 mg/g；第2 次提取液中含量為0.182 mg/g；第3 次提取含量為0.092 mg/g；第4 次提取含量為0.049 mg/g；第5 次提取含量為0.039 mg/g。由此結(jié)果可看出，第4 次與第5 次提取后所得的濾液中花青素含量極少，無法帶來更多效益，即基本沒有試驗(yàn)意義，故最終選擇以三級(jí)逆流的方式開展后續(xù)試驗(yàn)操作。

1.2.3 試驗(yàn)裝置及運(yùn)行過程

根據(jù)逆流提取理論[18]設(shè)置反應(yīng)容器，紫薯粉末在每一級(jí)提取容器中與酸性乙醇溶液反應(yīng)，并安裝冷凝回流裝置，以減少提取過程中的酒精損耗。啟動(dòng)反應(yīng)前調(diào)節(jié)容器溫度，并在整個(gè)提取過程中保持恒溫。在每次提取結(jié)束后，將反應(yīng)混合物靜置至室溫，以減少試驗(yàn)誤差。用漏斗和濾紙進(jìn)行固液分離操作，將濾紙上的紫薯粉末固形物用提取溶劑全部沖洗到下一級(jí)反應(yīng)容器中。

三級(jí)逆流提取裝置示意圖見圖1。

在反應(yīng)過程中，新的紫薯粉末從第一級(jí)加入，與提取溶劑反應(yīng)并分離后的固形物（P1） 順次向下一級(jí)轉(zhuǎn)移，同理，第二級(jí)反應(yīng)后，固液分離所得的粉末固形物（P2） 將被全部轉(zhuǎn)移到第三級(jí)提取容器中，第三級(jí)反應(yīng)結(jié)束后，移除粉末固形物（P3）。而提取溶劑運(yùn)動(dòng)方向相反，第三級(jí)反應(yīng)容器是添加新提取溶劑的地方，且第三級(jí)提取反應(yīng)并分離后的濾液（L3） 將作為第二級(jí)反應(yīng)的提取溶劑。同理，第二級(jí)提取反應(yīng)后的濾液（L2） 將用于第一級(jí)提取反應(yīng)，而第一級(jí)的提取溶劑經(jīng)過濾后，即為最終的花青素粗提液（L1）。

1.2.4 提取紫薯花青素的單因素分析

以一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液作為提取溶劑，在一定提取溫度、料液比、提取時(shí)間下，將紫薯花青素溶解于其中，是常用的提取方法，試驗(yàn)也采用乙醇溶液作為提取溶劑，以逆流提取方法，探索其最優(yōu)提取條件及提取效率。

（1） 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫薯花青素提取的影響。稱取適量紫薯粉末從第一級(jí)容器中加入，按照1∶10的料液比在第三級(jí)提取容器中分別加入體積分?jǐn)?shù)為30%，40%，50%，60%，70%的乙醇溶液（鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至1.5），在反應(yīng)過程中保持60 ℃恒溫，每份粉末的總反應(yīng)時(shí)間為2 h，即每一級(jí)反應(yīng)持續(xù)時(shí)間為2/3 h。 從提取溶劑加入第三級(jí)容器起，在其經(jīng)歷了第三級(jí)提取、第二級(jí)提取、第一級(jí)提取后，到第一級(jí)固液分離得到花青素粗提液為止的過程為一整個(gè)逆流提取流程。將經(jīng)歷整個(gè)逆流提取流程后得到的花青素粗提液以轉(zhuǎn)速6 000 r/min 離心1 min，收集上清液（即花青素溶液） 進(jìn)行后續(xù)分析。重復(fù)3 次，以平均值代表該因素下的提取效率。

（2） 料液比對(duì)紫薯花青素提取的影響。稱取適量紫薯粉末從第一級(jí)容器中加入，分別按照1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 的料液比在第三級(jí)提取容器中加入體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇溶液（鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至1.5），于60 ℃下恒溫，每份粉末的總反應(yīng)時(shí)間為2 h，即每一級(jí)反應(yīng)持續(xù)時(shí)間為2/3 h。然后，將經(jīng)歷整個(gè)逆流提取流程后得到的花青素粗提液以轉(zhuǎn)速6 000 r/min 離心1 min，收集所得上清液進(jìn)行后續(xù)分析。將以上流程重復(fù)3 次，以平均值代表該因素下的提取效率。

（3） 提取溫度對(duì)紫薯花青素提取的影響。稱取適量紫薯粉末從第一級(jí)容器中加入，按料液比1∶20在第三級(jí)提取容器中加入體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇溶液（鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至1.5），分別設(shè)置試驗(yàn)提取溫度為50，60，70，80，90 ℃，并在提取過程中保持恒溫，每份粉末的總反應(yīng)時(shí)間為2 h，即每一級(jí)反應(yīng)持續(xù)時(shí)間為2/3 h。然后，將經(jīng)歷整個(gè)逆流提取流程后得到的花青素粗提液以轉(zhuǎn)速6 000 r/min 離心1 min，收集所得上清液進(jìn)行后續(xù)分析。將以上流程重復(fù)3 次，以平均值代表該因素下的提取效率。

（4） 提取時(shí)間對(duì)紫薯花青素提取的影響。稱取適量紫薯粉末從第一級(jí)容器中加入，按料液比1∶20在第三級(jí)提取容器中加入體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇溶液（鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至1.5），設(shè)置試驗(yàn)提取溫度為80 ℃，每份粉末的總反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)置為2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h，即每一級(jí)反應(yīng)持續(xù)時(shí)間分別為2/3，5/6，1，7/6，4/3 h。將經(jīng)歷整個(gè)逆流提取流程后得到的花青素粗提液以轉(zhuǎn)速6 000 r/min 離心1 min，收集所得上清液進(jìn)行后續(xù)分析。將以上流程重復(fù)3 次，以平均值代表該因素下的提取效率。

1.2.5 提取紫薯花青素的多因素分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考查乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度和提取時(shí)間4 個(gè)因素對(duì)逆流提取法提取紫薯花青素的影響，以花青素得率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以期得到從紫薯中提取花青素的較好工藝。

L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.6 超聲波提取法

超聲波提取法是近年來研究紫薯花青素提取領(lǐng)域中的一大熱點(diǎn)，多項(xiàng)研究圍繞超聲波法提取紫薯花青素展開[14，17，27]，并認(rèn)為是目前提取紫薯花青素最好的方法。紫薯品種不同，其中花青素含量也存在差異，由于缺乏不同提取方法對(duì)同一紫薯品種提取花青素效率的參考文獻(xiàn)，在進(jìn)行該項(xiàng)工作時(shí)，張衛(wèi)波等人[28]用超聲波法提取花青素的工藝被選擇，用于與該試驗(yàn)方法進(jìn)行比較，評(píng)判二者的優(yōu)劣。其最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，超聲溫度30 ℃，超聲時(shí)間10 min，紫薯與提取劑的料液比1∶25，提取完畢后將粗提液以轉(zhuǎn)速6 000 r/min 離心1 min，對(duì)上清液即為花青素溶液進(jìn)行含量測定。將以上流程重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

1.3 花青素含量測定

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照文獻(xiàn)[29]，具體操作為精密稱取0.100 g （準(zhǔn)確至0.001 g） 莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)品100 mL 容量瓶中，加去離子水（pH 值7.0） 定容，得到質(zhì)量濃度1 mg/mL 的莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)液。分別移取0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00，3.50 mL 至50 mL容量瓶中，用去離子水（pH 值7.0） 定容。于波長520 nm 處測吸光度，以莧菜紅溶液為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為Y=0.288 4X+ 0.060 9，R2=0.999 6。

莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

1.3.2 花青素含量的測定

將待測花青素溶液用乙醇溶液（pH 值1.5） 進(jìn)行稀釋，于波長520 nm 處測吸光度[30]，每組試驗(yàn)設(shè)置3 次平行，結(jié)果取平均數(shù)。再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出提取液質(zhì)量濃度C （10-5g/mL），計(jì)算紫薯花青素得率P，計(jì)算公式為：

式中：V——提取液體積，mL；

n——稀釋倍數(shù)；

M——紫薯粉末質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫薯花青素含量的影響乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花青素含量的影響見圖3。

由圖3 可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)花青素含量最高。一定范圍內(nèi)，乙醇體積分?jǐn)?shù)越大提取效果越差，推測可能因?yàn)榛ㄇ嗨貙儆谒苄陨兀掖俭w積分?jǐn)?shù)越高其水占比越小，反而不利于花青素的提取。而在體積分?jǐn)?shù)為70%之后得率又有上升，可能是高體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)細(xì)胞有了殺傷作用，從而使得細(xì)胞內(nèi)的花青素被提取出來。

2.1.2 料液比對(duì)紫薯花青素含量的影響

料液比對(duì)花青素含量的影響見圖4。

圖4 料液比對(duì)花青素含量的影響

由圖4 可知，在料液比過小時(shí)，提取液容易達(dá)到相對(duì)飽和，并且量相對(duì)更少，所以不利于花青素的工業(yè)提取；而在料液比過大時(shí)，提取液內(nèi)花青素濃度變化不大，但原料用量增加，出現(xiàn)不必要的浪費(fèi)。由此得知，當(dāng)料液比為1∶20 時(shí)，花青素的提取效果最好。

2.1.3 提取溫度對(duì)紫薯花青素含量的影響

提取溫度對(duì)花青素含量的影響見圖5。

由圖5 可知，提取溫度為80 ℃時(shí)，花青素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他提取溫度。在一定范圍內(nèi)，提取溫度的升高有利于分子運(yùn)動(dòng)，還可起到破壞細(xì)胞的作用，從而有利于花青素的釋放。但超過一定提取溫度界限，花青素受熱被破壞[7]，提取到的量反而減少。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)紫薯花青素含量的影響

提取時(shí)間對(duì)花青素含量的影響見圖6。

由圖6 可知，一定范圍內(nèi)，花青素含量隨著提取時(shí)間增加而增加，可能是因?yàn)橛谐渥愕臅r(shí)間利于花青素從細(xì)胞內(nèi)充分釋放。當(dāng)提取時(shí)間過長，一是花青素容易分解，二是時(shí)間成本增加。因此，3.5 h是提取花青素的最佳時(shí)間。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

由表2 可以得知，各個(gè)因素影響試驗(yàn)結(jié)果的主次順序?yàn)镈＞C＞A＞B，即料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞提取時(shí)間。由此結(jié)果可知，料液比對(duì)于逆流提取效果的影響是最大的，設(shè)置合適的料液比不僅能將提取效果最大化，還能提高原料利用率，避免成本浪費(fèi)。乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)于逆流提取也有較大的影響作用，選擇合適的體積分?jǐn)?shù)能夠促使提取效果達(dá)到最好。相對(duì)而言，提取溫度和提取時(shí)間對(duì)最終提取效果的影響不如前2 項(xiàng)，但保持適宜的提取溫度、設(shè)置最佳的提取時(shí)間，也能進(jìn)一步提高逆流提取的效率。

最終得出逆流提取法在提取紫薯花青素時(shí)的最佳工藝條件為A3B2C1D3，即酸性乙醇體積分?jǐn)?shù)30%，料液比1∶25，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間3.5 h，此時(shí)花青素含量為1.245 mg/g。

2.3 超聲波提取試驗(yàn)結(jié)果與分析

在文獻(xiàn)所示的最佳試驗(yàn)條件下[28]，對(duì)同一批次紫薯粉末進(jìn)行超聲波提取，所得花青素含量為0.513 mg/g，而運(yùn)用逆流提取法的花青素含量為1.245 mg/g。由結(jié)果得知，逆流提取法的提取效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于超聲波提取法。

3 結(jié)論

直接提取法是最原始的提取方法之一，操作時(shí)只需將原料和提取溶劑充分混合后，進(jìn)行一次性靜置提取即可。王兆雨等人[15]以體積分?jǐn)?shù)50%乙醇為提取劑，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間60 min，pH 值調(diào)節(jié)至3.5 為提取條件，進(jìn)行了紫薯花青素的直接提取試驗(yàn)。此時(shí)，原料中花青素的提取率為5.8%。直接提取法操作簡單易行，但也有提取時(shí)間較長、原料利用率低、提取效率低等缺點(diǎn)。

用纖維素酶和果膠酶進(jìn)行輔助從紫薯粉末中提取花青素也是常用方法之一。這2 種酶都有破壞植物細(xì)胞壁的作用[16]，能促使花青素從細(xì)胞中大量釋放并在萃取劑中迅速溶解。雖然酶輔助法提取效果優(yōu)于直接提取法，但其實(shí)質(zhì)并未發(fā)生改變，仍然是一次性靜置提取。并且酶解法提取成本較高，對(duì)試驗(yàn)的溫度要求也較嚴(yán)格。因此，不適合于工業(yè)提取花青素。

微波法的原理是原料粉末吸收了微波能量，使細(xì)胞內(nèi)的溫度迅速升高，細(xì)胞內(nèi)的壓力超過細(xì)胞壁的膨脹能力，從而導(dǎo)致植物細(xì)胞破裂，其內(nèi)的活性成分自由流出。Sun Y Z 等人[16]通過響應(yīng)面法探究微波法提取紫甘薯花青素的最佳條件，結(jié)果是以鹽酸乙醇作為提取劑，料液比1∶5，提取溫度71 ℃，提取時(shí)間53 min，得到的最終含量為363.90 μg/g。 然而，微波法在溶劑的選擇上有一定的局限性，這也在一定程度上限制了微波在工業(yè)提取紫薯花青素中的應(yīng)用。

與微波法不同的是，超聲波法在提取過程中產(chǎn)生高速強(qiáng)烈的空化作用和攪拌作用，破壞植物細(xì)胞，使溶劑大量滲透到細(xì)胞中，從而大大提高了提取效率。超聲波法不僅提取時(shí)間短，而且提取溫度低、提取范圍廣泛。這就決定了超聲波法在近年來眾多紫薯花青素提取研究中的重要地位。回晶等人[17]使用鹽酸乙醇作為提取劑，料液比1∶40，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間25 min，花青素的最終含量為324.87 μg/g。關(guān)于2 種提取方法聯(lián)合作用的研究也有發(fā)表[31]，研究者將超聲波和纖維素酶共同作用于紫薯花青素的提取過程，其在最適條件下的花青素得率為8.77%。

試驗(yàn)選取了當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的超聲波提取法與逆流提取法相比較[32]。在參考文獻(xiàn)所示的最適條件下[28]，超聲波提取法與逆流提取法使用同一批次紫薯粉末分別進(jìn)行花青素提取試驗(yàn)，其中花青素含量的測定與計(jì)算方式均相同，試驗(yàn)得出的最終結(jié)論為逆流提取的花青素含量為1.245 mg/g，而超聲波提取法的花青素含量為0.513 mg/g。由此可知，相較于其他方法，逆流提取在花青素得率方面有著無可比擬的優(yōu)勢，這也給紫薯花青素提取工業(yè)帶來了新方向。因此，逆流提取法在紫薯花青素的工廠化提取中具有極大的應(yīng)用前景。