接種物對模擬田間厭氧發(fā)酵系統(tǒng)甲烷生產(chǎn)和秸稈降解的作用

秦 凱，陳芳清，張 行，黃永文，劉楊赟

（1.湖北省三峽地區(qū)生態(tài)保護(hù)與治理國際聯(lián)合研究中心，湖北 宜昌 443002；2.湖北正江環(huán)保科技有限公司，湖北 宜昌 443002)

0 引言

我國是農(nóng)業(yè)大國，擁有豐富的農(nóng)作物秸稈資源，僅2017年我國秸稈的理論資源總量就已達(dá)10.2億t[1]。農(nóng)作物秸稈作為重要的生物資源，具有多種用途，但由于我國農(nóng)村燃料結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，秸稈轉(zhuǎn)化技術(shù)尚不成熟等原因，其利用率較低，多被遺棄或焚燒，不僅造成了資源浪費(fèi)還引發(fā)了諸多環(huán)境問題[2-3]。在化石能源逐漸枯竭，能源緊張的背景下，農(nóng)作物秸稈作為一種富含有機(jī)質(zhì)（80%～90%）的生物質(zhì)已成為一種重要的新能源[4]。厭氧發(fā)酵技術(shù)既能實(shí)現(xiàn)秸稈的資源化利用，又能生產(chǎn)清潔的生物能源，是實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物秸稈資源化利用的有效途徑之一，國內(nèi)外學(xué)者對此展開了廣泛研究[5]。秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)生物甲烷的方式可分為設(shè)施發(fā)酵（發(fā)酵罐和沼氣池）和田間實(shí)地發(fā)酵[6-7]。田間實(shí)地發(fā)酵產(chǎn)甲烷技術(shù)是利用特制的膜系統(tǒng)覆蓋，再通過水淹基部土壤在田間營造無氧環(huán)境，將秸稈和土壤混合后進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)生物甲烷，最后通過收集系統(tǒng)將氣體收集起來加以利用。該技術(shù)既能把秸稈轉(zhuǎn)化為清潔能源，改善土壤結(jié)構(gòu)，又避免了傳統(tǒng)發(fā)酵工程中存在的運(yùn)輸難、成本高等問題，且經(jīng)過國產(chǎn)化生產(chǎn)，其設(shè)施成本已降低了87.75%，既具生態(tài)效益又具有經(jīng)濟(jì)效益，具有良好的應(yīng)用前景[8]。

在秸稈厭氧發(fā)酵過程中，不同的接種物因含有不同的菌群，會直接影響厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的進(jìn)程和效率。加入充足、優(yōu)質(zhì)的厭氧活性微生物作為接種物可以提高秸稈厭氧發(fā)酵的降解速率和生物甲烷產(chǎn)量，縮短啟動時間等[9]。因此，對高效接種物篩選及其作用機(jī)理研究一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[10]。如GU 等[11]評估了牛糞沼液、豬糞沼液、雞糞沼液3 種沼液和市政消化污泥、消化顆粒污泥和造紙廠污泥3 種污泥用作接種物和稻稈進(jìn)行厭氧發(fā)酵的效果，發(fā)現(xiàn)沼液比污泥更適合作接種物。目前，田間實(shí)地厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷技術(shù)的研究僅限于以稻田土壤中的微生物作為接種物來源，存在接種物單一、產(chǎn)氣效率低下等問題[7]，尚未開展有關(guān)接種物的深入研究。為此，本研究開展了不同接種物對模擬水稻秸稈田間厭氧發(fā)酵系統(tǒng)甲烷生產(chǎn)和秸稈降解作用的研究。本研究根據(jù)田間實(shí)地發(fā)酵產(chǎn)甲烷技術(shù)研發(fā)的需求，在實(shí)驗室內(nèi)控制溫度的條件下，模擬田間實(shí)地厭氧發(fā)酵系統(tǒng)，通過添加不同液體接種物，測定各處理累積產(chǎn)氣量、甲烷含量和秸稈降解率的變化，揭示接種物對田間實(shí)地厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷及秸稈降解的影響，為秸稈田間實(shí)地厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷技術(shù)在我國的推廣與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗裝置與材料

1.1.1 試驗裝置

本試驗在模擬田間實(shí)地厭氧發(fā)酵原理的發(fā)酵裝置內(nèi)進(jìn)行，該裝置包括有效容積分別為2 L 的發(fā)酵瓶和550 mL 的集氣瓶。其中發(fā)酵瓶用于混裝秸稈、土壤浸出液和接種物，用瓶蓋密封以營造發(fā)酵無氧環(huán)境。發(fā)酵瓶瓶蓋上鉆出2 孔，分別作為取樣孔和集氣孔，用硅膠管連接集氣孔與集氣瓶收集產(chǎn)氣。取樣孔平日用止水夾封閉。

1.1.2 發(fā)酵原料與接種物

試驗所用水稻秸稈取自湖北省枝江農(nóng)科院水稻田，取回后經(jīng)自然風(fēng)干，切碎至3～5 cm 小段，測得總有機(jī)碳（TOC）質(zhì)量分?jǐn)?shù)為431.39 g/kg，總氮（TN）質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.22 g/kg，含水率為6.01%。經(jīng)尿素溶液氨化預(yù)處理（使發(fā)酵底物碳氮比約為20 ∶1）5 d 后備用。為模擬田間發(fā)酵系統(tǒng)水淹特點(diǎn)及避免土壤吸附能力對試驗結(jié)果造成影響，以土壤浸出液的方式添加土壤微生物，土壤取自于湖北枝江農(nóng)科院長期種植水稻的稻田，取回后參照楊軍等[12]的方法，以1 kg 土壤添加1 L 去離子水浸泡，攪拌均勻，待充分浸出后，靜置過濾，留取清液備用。試驗所用的接種物為沼液和豬糞浸出液，沼液和豬糞取自湖北枝江農(nóng)科院沼氣池和養(yǎng)殖場。豬糞取回后參照楊軍等[12]的方法進(jìn)行豬糞浸出液的制取，以1 kg 新鮮豬糞添加1 L 去離子水浸泡，攪拌均勻，靜置過濾。接種物均濾去殘渣，留其清液備用。試驗材料的特性見表1。

表1 發(fā)酵原料與接種物的特性

1.2 試驗設(shè)計

試驗以接種物種類為試驗因子，接種物處理包括500 mL 的沼液和豬糞浸出液、以及500 mL 體積比為1 ∶1 的沼液+ 豬糞浸出液混合液，分別標(biāo)記為A，B，C。另外還設(shè)置添加等體積500 mL 去離子水的對照組，標(biāo)記為CK。每個處理水平均設(shè)置3 個重復(fù)，共計12 組試驗。以經(jīng)氨化預(yù)處理5 d 后的水稻秸稈為原料，干物質(zhì)質(zhì)量均為80 g，添加500 mL 稻田土壤浸出液作為環(huán)境基質(zhì)，然后分別添加上述接種物，混勻后密封置于30±1 ℃恒溫氣候箱內(nèi)進(jìn)行厭氧發(fā)酵試驗。根據(jù)湖北地區(qū)一般于4月中下旬到9月中下旬大面積種植中稻的特點(diǎn)，農(nóng)閑期較長，整個發(fā)酵試驗為期90 d，試驗期間每日觀察產(chǎn)氣情況，并記錄相關(guān)參數(shù)。

1.3 測定指標(biāo)與方法

在試驗前分別測定了發(fā)酵原料的TOC，TN，TS和原料揮發(fā)性固體（VS）。其中TOC 用K2Cr2O7-外熱源法測定，TN 采用全自動凱氏定氮儀測定，TS 的測定用干燥恒重法，VS 的測定用灼燒恒重法。厭氧發(fā)酵期間每5 d 對各處理的產(chǎn)氣量和甲烷含量進(jìn)行測定，產(chǎn)氣量測定方法為排水法，甲烷含量測定用氣相色譜法，同時吸取少量發(fā)酵液利用比色法測定其揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）質(zhì)量濃度。并在氨化預(yù)處理前后和整體試驗后分別從各處理取秸稈樣品測定其纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量，測定方法分別為72%濃硫酸水解法、2 mol/L 鹽酸水解法和濃硫酸法。秸稈木質(zhì)纖維素降解率和總降解率的計算公式如下：

式中：Rh為秸稈木質(zhì)纖維素降解率，%；S0為處理前木質(zhì)纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；Se處理后木質(zhì)纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；Rd為秸稈總降解率，%；m0為處理前秸稈干物質(zhì)質(zhì)量，g；me為處理后秸稈干物質(zhì)質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計與初步分析，以平均值繪制曲線圖，分析不同接種物厭氧發(fā)酵進(jìn)程中甲烷產(chǎn)氣量、甲烷含量、pH 值、VFAs 質(zhì)量濃度的動態(tài)變化；以接種物種類為變量，以90 d 發(fā)酵試驗的累積產(chǎn)氣量、TS 產(chǎn)氣率和秸稈木質(zhì)纖維素含量為因變量，采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，分析接種物種類對厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣和秸稈降解的影響，當(dāng)單因子作用效果影響達(dá)到顯著水平時（p＜0.05），采用S-N-K 法進(jìn)行多重比較，分析各處理之間的差異水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種物對水稻秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷進(jìn)程的影響

各試驗組甲烷產(chǎn)氣量、甲烷含量、VFAs 質(zhì)量濃度和pH 值隨時間變化均呈大致相同的變化趨勢見圖1。由圖1 可知，甲烷產(chǎn)氣量呈下降-上升-下降的變化，甲烷含量呈上升-下降的變化，pH 值則呈下降-上升的變化，而VFAs 呈上升-下降的變化。接種物種類對水稻秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷進(jìn)程有一定影響。因接種物厭氧發(fā)酵菌群的不同，各處理相關(guān)參數(shù)峰值出現(xiàn)的時間、峰值的大小均有差異。圖1（a）中甲烷產(chǎn)氣量方面，對照值（CK）處理在第25 天才開始產(chǎn)氣，其余處理在第5 天即開始產(chǎn)氣，但經(jīng)歷了10～25 d 的產(chǎn)氣停滯期。隨后各處理進(jìn)入產(chǎn)氣高峰期，峰值出現(xiàn)在第35～55 d 之間。在甲烷產(chǎn)氣量方面以A 處理的峰值最高（336.78 mL），以CK 處理的峰值最低（115.04 mL），前者比后者高192.75%；圖1（b）中甲烷含量方面，以A 處理的峰值最高（69.62%），以CK 處理的峰值最低（53.17%），前者比后者高30.94%。

圖1 不同接種物對厭氧發(fā)酵的影響

圖1（c）中VFAs 質(zhì)量濃度方面，各處理在厭氧發(fā)酵第10 d 時有一個高峰，隨后A 和B 處理VFAs質(zhì)量濃度開始下降，而C 和CK 處理則繼續(xù)上升。以C 處理的峰值最高（4.33 g/L），以CK 處理的峰值最低（3.18 g/L），前者比后者高36.16%；圖1（d）中pH值方面，不同試驗組pH 值的變化范圍有較大差異，A 和B 處理pH 值變化范圍較小，分別在6.38～7.48和6.22～7.47；C處理的pH值變化范圍在5.82～7.39；CK 處理的pH 值變化范圍最大，在5.43～7.18。

2.2 接種物種類對水稻秸稈厭氧發(fā)酵累積產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣率的影響

接種物種類對水稻秸稈厭氧發(fā)酵累積產(chǎn)氣量和TS 產(chǎn)氣率存在的顯著影響（p ＜0.05）見圖2。由圖2可知A 和B 處理對水稻秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣具有促進(jìn)作用，相比于CK，A 處理累積產(chǎn)氣量和TS 產(chǎn)氣率提高了70.82%，B 處理累積產(chǎn)氣量和TS 產(chǎn)氣率提高了42.66%。C 處理對累積產(chǎn)氣量和TS 產(chǎn)氣率均無顯著影響（p ＞0.05），累積產(chǎn)氣量和TS 產(chǎn)氣率相比CK 組僅提高了4.28%。

圖2 不同接種物對厭氧發(fā)酵累積產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣率的影響

2.3 接種物種類對水稻秸稈降解的影響

接種物種類對水稻秸稈的木質(zhì)纖維素含量和干物質(zhì)質(zhì)量的顯著影響（p ＜0.05）見表2。經(jīng)厭氧發(fā)酵后，秸稈纖維素和半纖維素被厭氧微生物大量分解，其含量大幅降低，而木質(zhì)素因難以降解其含量反而升高。A，B，C 各處理纖維素降解率分別為42.20%，39.39%和32.06%，而CK 僅為21.46%；A，B，C 各處理半纖維素降解率分別為42.70%，34.78%和40.61%，CK 僅為30.04%；A，B，C 各處理秸稈總降解率分別為54.71%，54.29%和41.79%，CK 僅為30.30%。各處理中以A 處理的纖維素降解率、半纖維素降解率和總降解率均最高，相比CK 組分別提高了96.64%，42.14%和80.56%。

表2 添加不同接種物對厭氧發(fā)酵秸稈成分的影響

3 討論

3.1 接種物種類對厭氧發(fā)酵進(jìn)程的影響

厭氧發(fā)酵產(chǎn)生物甲烷是一個復(fù)雜的進(jìn)程，包括水解酸化、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸和產(chǎn)甲烷等3 個階段[13]。在水解酸化階段，先由水解菌將木質(zhì)纖維素等復(fù)雜聚合物水解為單一或較復(fù)雜的化合物，再由酸化菌將其分解為單糖、氨基酸、脂肪酸等產(chǎn)物。在產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸階段，產(chǎn)酸菌進(jìn)一步將各種脂肪酸降解為乙酸、二氧化碳和氫氣。在產(chǎn)甲烷階段，產(chǎn)甲烷菌主要利用乙酸、氫氣、二氧化碳等簡單的物質(zhì)生產(chǎn)甲烷以及合成自身的細(xì)胞物質(zhì)。以上3 個階段非產(chǎn)甲烷菌和產(chǎn)甲烷菌間通過協(xié)同作用、拮抗作用共同維系厭氧發(fā)酵微生物群落的穩(wěn)定性，任何階段微生物種類和數(shù)量發(fā)生變化，都會對厭氧發(fā)酵進(jìn)程產(chǎn)生影響[14]。

本試驗中，添加接種物后，各處理對產(chǎn)氣量和產(chǎn)甲烷含量的變化趨勢沒有改變，但是各處理產(chǎn)甲烷啟動時間、停滯期、峰值出現(xiàn)的時間、峰值的大小均有較大變化，其同期的pH 值和VFAs 質(zhì)量濃度也發(fā)生相應(yīng)的變化。出現(xiàn)差異的原因是不同接種物所含有的微生物類群的差異所導(dǎo)致的[15]。添加單一沼液和豬糞浸出液的處理，接種物均含有由產(chǎn)甲烷菌和非產(chǎn)甲烷菌組成的厭氧發(fā)酵菌群，如能夠降解有機(jī)物的厚壁菌門，能利用所有產(chǎn)甲烷途徑的甲烷八疊球菌屬等，但其優(yōu)勢菌群的差異導(dǎo)致發(fā)酵進(jìn)程有所差異。接種物的添加不僅能改善厭氧發(fā)酵微生物菌群結(jié)構(gòu)，還能抑制脂肪酸的累積，有利于快速啟動厭氧發(fā)酵和提高甲烷產(chǎn)量[16]，因此其厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷啟動速度、產(chǎn)甲烷峰值和甲烷含量均顯著高于對照。添加混合接種物的處理，雖然在啟動速度、產(chǎn)甲烷峰值方面均高于對照，但在緩解酸累積方面卻低于對照。其原因可能是混合接種物使微生物群落失去平衡，接種物和發(fā)酵基質(zhì)中的酸解菌種類和數(shù)量較多，產(chǎn)甲烷菌的種類和數(shù)量較少，發(fā)酵基質(zhì)分解較快，產(chǎn)生酸累積。由于產(chǎn)甲烷菌最適pH 值在6.8～7.2，酸累積導(dǎo)致產(chǎn)酸菌活性高于產(chǎn)甲烷菌，VFAs 過量累積。

3.2 接種物種類對秸稈降解和甲烷生產(chǎn)的影響

秸稈中主要的化學(xué)成分是木質(zhì)纖維素，纖維素和半纖維素被疏水的木質(zhì)素層緊密包裹,且木質(zhì)素最難以被微生物降解利用，因此秸稈的水解是厭氧發(fā)酵的限速步驟，影響秸稈的轉(zhuǎn)化效率[17]。秸稈厭氧發(fā)酵降解和產(chǎn)甲烷的過程是一個產(chǎn)甲烷菌和非產(chǎn)甲烷菌相互作用，相互制約的過程：①在厭氧發(fā)酵中，厚壁菌門夠降解復(fù)雜有機(jī)物，擬桿菌門和變形菌門則是水解和產(chǎn)酸的主要菌群[18]，這些水解菌和酸化菌等微生物促進(jìn)秸稈降解為單糖、氨基酸、脂肪酸等產(chǎn)物。秸稈的降解本身受水解菌和酸化菌的影響，提高水解菌和酸化菌的數(shù)量與活性能促進(jìn)秸稈的分解；②秸稈降解可為產(chǎn)甲烷菌提供可供利用的小分子和眾多副產(chǎn)物，如VFAs，NH4+，H2S 等，若小分子和眾多副產(chǎn)物能及時被產(chǎn)甲烷菌利用形成甲烷，則秸稈的降解和甲烷的生產(chǎn)都會順利進(jìn)行。但是當(dāng)小分子和眾多副產(chǎn)物不能被產(chǎn)甲烷菌利用形成甲烷，則會導(dǎo)致中間產(chǎn)物的累積，抑制水解菌和酸化菌的生長與活性，從而影響對秸稈的分解與利用。

已有的研究表明，混合微生物菌群間的協(xié)同作用能更好地促進(jìn)生物質(zhì)固體廢物的厭氧消化，是提高生物質(zhì)固體廢物可降解性的有效途徑。本試驗中添加接種物的各處理纖維素、半纖維素的降解率和總降解率均顯著高于對照組，其中以添加沼液和豬糞浸出液對秸稈的降解效果最好。接種物的添加還能提高累積產(chǎn)氣量，其中也以添加沼液和豬糞浸出液的單一接種物處理最為顯著，其TS 產(chǎn)氣率也顯著高于對照組。其原因是接種物中所含有的水解菌、酸化菌和產(chǎn)甲烷菌構(gòu)成了穩(wěn)定的厭氧發(fā)酵菌群，使秸稈得到更徹底的分解[16]。混合接種物對秸稈的降解效果和累積產(chǎn)氣量雖高于對照組，但卻低于單一接種物處理，其原因可能是混合接種物的微生物菌群不具有互補(bǔ)性，并存在拮抗作用。這種作用使得非產(chǎn)甲烷菌和產(chǎn)甲烷菌處于不穩(wěn)定的非平衡狀態(tài)，產(chǎn)甲烷菌的作用受到影響，最終影響秸稈的降解和甲烷的生產(chǎn)效率。本實(shí)驗中，各處理所含微生物種類的具體差異及其效應(yīng)將另外成文進(jìn)一步分析。

4 結(jié)論

（1）添加接種物對厭氧發(fā)酵產(chǎn)生物甲烷的變化趨勢沒有影響，但可縮短產(chǎn)氣停滯期，緩解厭氧發(fā)酵前期的酸化，促進(jìn)甲烷產(chǎn)氣峰值提前出現(xiàn)和提高峰值。其中以添加沼液的試驗組最先恢復(fù)產(chǎn)氣，甲烷產(chǎn)氣峰值出現(xiàn)在第45 天，為336.78 mL，相比對照組提高了192.75%。

（2）添加接種物可有效促進(jìn)秸稈降解，各處理的纖維素、半纖維素降解率和總降解率均顯著高于對照組。其中添加沼液的試驗組纖維素、半纖維素降解率分別比對照提高96.64%和42.14%，總降解率則提高80.56%。

（3）添加接種物可有效提高秸稈厭氧發(fā)酵的累積產(chǎn)氣量和TS 產(chǎn)氣率。其中添加沼液的試驗組累積產(chǎn)氣量最高為4 458.33 ±99.85 mL，TS 產(chǎn)氣率最高為59.29±1.33 mL/g，相比對照組提高了70.82%。