綿馬貫眾素對(duì)馬鈴薯干腐病菌的抑菌活性研究

高云飛，王文重,2*，宿飛飛，閔凡祥，劉振宇，魏 琪，萬書明

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，黑龍江 哈爾濱150086；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站，黑龍江 哈爾濱150086）

馬鈴薯干腐病是由鐮孢菌屬（Fusariumspp.）引起的一種世界性范圍的真菌病害，也是窖貯期間馬鈴薯主要病害之一。在窖藏過程中，由干腐病造成的損失率一般為10%～35%，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)60%[1-4]，給馬鈴薯產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。由于馬鈴薯沒有抗鐮刀菌干腐病品種，因此只能通過化學(xué)藥劑進(jìn)行防控，但長(zhǎng)期大量施用化學(xué)藥劑易造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，還會(huì)導(dǎo)致鐮孢菌產(chǎn)生抗藥性，防治效果逐年降低。閔凡祥等[6]和李鳳蘭等[7]都曾報(bào)道，從有典型馬鈴薯干腐病癥狀的薯塊中成功分離得到接骨木鐮孢菌（F.sambucinum）、燕麥鐮孢菌（F.avenaceum）和茄病鐮孢菌藍(lán)色變種（F.solamivar.coeruleum），其致病率分別為87.5%、70.2%和40.25%；黃色鐮刀菌（F.culmorum）和燕麥鐮刀菌（F.avenaceum）對(duì)離體塊莖的致病率分別為41.05%和72.20%。目前，利用植物源殺菌藥防治馬鈴薯干腐病鐮孢菌已成為研究熱點(diǎn)，對(duì)鐮孢菌的研究已有一些報(bào)道。王靜等[8]的研究表明，丹參、半夏、仙人掌等藥用植物的丙酮粗提物對(duì)串珠鐮刀菌（F.moniliforme）、禾谷鐮刀菌（F.graminearum）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）有一定的抑制效果。但關(guān)于蕨類植物對(duì)鐮孢菌抑制作用的研究尚且不多。粗莖麟毛蕨（Dryopteris crassirhizoma）為鱗毛蕨科鱗毛蕨，屬多年生草本植物，是中國(guó)藥典收載的中藥材貫眾的原植物，主要分布于東北和河北的東北部地區(qū)[9]。粗莖鱗毛蕨的干燥根莖又稱為綿馬貫眾，綿馬貫眾含有多種間苯三酚類化合物、黃酮類化合物和萜類化合物[10-12]。現(xiàn)已知間苯三酚單體成分為綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA和白綿馬素AA[13,14]。研究表明，綿馬貫眾煎劑能有效的抑制傷寒桿菌（Salmonella enterica）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等。間苯三酚衍生物能抑制乳酸桿菌（Lactobacillus）生長(zhǎng)[15]，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌有一定抑菌作用[16]。因此開發(fā)高效、低毒植物源殺菌藥是防治馬鈴薯干腐病的有效措施。

本研究通過生長(zhǎng)速率法測(cè)定粗莖鱗毛蕨提取物綿馬貫眾素ABBA對(duì)馬鈴薯干腐病鐮孢菌的抑制效果，進(jìn)一步研究綿馬貫眾素ABBA對(duì)接骨木鐮孢菌菌絲和孢子萌發(fā)抑制作用，為合理研發(fā)植物源農(nóng)藥提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

黃色鐮孢菌、接骨木鐮孢菌、燕麥鐮孢菌、茄病鐮孢菌藍(lán)色變種。均由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所提供。

1.1.2 植物材料

粗莖鱗毛蕨植株于2012年8月采自黑龍江省帽兒山，采收植物材料陰干后粉碎，過40目篩備用。粗莖鱗毛蕨植株標(biāo)本保存于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物教研室。

1.1.3 主要試劑

綿馬貫眾素ABBA標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥95%）購(gòu)買于上海源葉生物科技有限公司；甲醇為美國(guó)DIKMA公司的色譜純，其他試劑均為分析純。

1.1.4 主要儀器

Waters 600型高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世），Waters 2847型紫外檢測(cè)器（美國(guó)沃特世），Waters 2707自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)沃特世）；RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市英峪予華儀器廠）；KQ2200B型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市舒美超聲儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)了雙因素完全隨機(jī)試驗(yàn)，3次重復(fù)。其中因素A為濃度，分別為0.5和1 mg/mL；因素B為菌種，分別為黃色鐮孢菌，燕麥鐮孢菌，接骨木鐮孢菌和茄病鐮孢菌藍(lán)色變種。試驗(yàn)在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 粗莖鱗毛蕨中綿馬貫眾素ABBA提取

稱取500 g粗莖鱗毛蕨粉末，按料液比1∶10加入到80%的乙醇溶液中，避光冷浸24 h，在功率800 W 30℃的超聲波下浸提2次，30 min。浸提液以5 000 r/min離心，取上清，真空抽濾，合并濾液。用正己烷以1∶1萃取濾液，混勻靜置，取上層液體，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至膏。用15%乙醇以10倍量對(duì)浸膏進(jìn)行溶解，用酸堿調(diào)至中性。DM-130大孔樹脂預(yù)處理[17]后將上述的液體樣品加入到經(jīng)處理過的DM-130大孔吸附樹脂吸附柱內(nèi)，先用蒸餾水洗，再分別經(jīng)過30%和50%甲醇清洗，棄濾液，用90%甲醇洗脫吸附柱，濾液為含有綿馬貫眾素ABBA成分的藥液，備用。

1.3.2 HPLC法綿馬貫眾素ABBA的含量測(cè)定

精確稱量10 mg綿馬貫眾素ABBA標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容為25 mL。再精密吸取1，2，3，4和5 mL，用甲醇定容100 mL，得到質(zhì)量濃度分別4，8，12，16和20 ng/μL的綿馬貫眾素ABBA標(biāo)準(zhǔn)溶液。色譜條件參考金哲[18]和肖國(guó)君等[19]略有修改。色譜柱：Waters 600 C18柱（250 mm×4.6 mm，10μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.5 %磷酸水95%～100%甲醇梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：20℃；檢測(cè)波長(zhǎng)300 nm。定量測(cè)定方法采用外標(biāo)法。配置不同濃度的提取液。

1.3.3 綿馬貫眾素ABBA提取液對(duì)鐮孢菌抑菌活性測(cè)定

提取液對(duì)鐮孢菌的影響采用生長(zhǎng)速率法[20]，在配制不同濃度植物提取液時(shí)，采用超聲波法助溶[21]。一切操作均在無菌條件下進(jìn)行，取9 mL上述植物提取液加入PDA培養(yǎng)基中，混勻，以等量無菌水為對(duì)照。將經(jīng)活化的供試鐮刀菌接種到PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取生長(zhǎng)狀況一致的供試菌餅（Ф=6.0 mm），將有菌絲的一面貼在PDA培養(yǎng)基表面上，25℃培養(yǎng)，等對(duì)照組菌落直徑占培養(yǎng)基2/3時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量，計(jì)算的菌落生長(zhǎng)量，每個(gè)處理重復(fù)3次。按照下列公式計(jì)算抑制率：

純生長(zhǎng)量=菌落平均直徑-菌餅直徑

抑制率（%）=（對(duì)照菌落純生長(zhǎng)量-處理菌落純生長(zhǎng)量）/對(duì)照菌落純生長(zhǎng)量×100

1.3.4 綿馬貫眾素ABBA提取液對(duì)接骨木鐮孢菌孢子萌發(fā)率的測(cè)定

取25℃培養(yǎng)7 d含有接骨木鐮孢菌的培養(yǎng)皿，加入少量無菌水，將其上的菌絲刮下，轉(zhuǎn)入已滅菌的三角瓶中，振蕩、過濾，最后通過血球計(jì)數(shù)板將孢子濃度稀釋到1×105cfu/mL備用。

取等量的不同濃度的綿馬貫眾素ABBA溶液、無菌水、上述孢子菌液和PD液體培養(yǎng)基，加入無菌離心管中，混合均勻，25℃培養(yǎng)。每1 h鏡檢記錄1次孢子萌發(fā)數(shù)，共調(diào)查5次，每次鏡檢200個(gè)孢子，每個(gè)處理3次重復(fù)。

孢子萌發(fā)率（%）=孢子萌發(fā)數(shù)/調(diào)查孢子總數(shù)×100

1.3.5 綿馬貫眾素ABBA提取液對(duì)接骨木鐮孢菌菌絲干重的測(cè)定

在50 mL PD液體培養(yǎng)基中接種接骨木鐮孢菌的菌餅（Ф=6 mm）5片，按體積比2%接種量分別接種0.1和0.5 mg/mL的綿馬貫眾素ABBA，加入等量的無菌水作為對(duì)照組。25℃100 r/min振蕩，培養(yǎng)15 d，用紗布過濾收集菌絲，烘干并稱重，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用Excel 2010和DPS 15.10完成。采用完全隨機(jī)雙因素有重復(fù)方差分析方法，多重比較采用最小顯著差數(shù)法（Least Significant Different）。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿馬貫眾素ABBA提取液含量測(cè)定

綿馬貫眾素ABBA標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間在7 min左右（圖1），表明綿馬貫眾素ABBA標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)色譜峰的紫外吸收光譜有良好的分離效果，能夠用來分離樣品中的綿馬貫眾素ABBA。綿馬貫眾素ABBA含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.052 8X-0.159 1（其中Y為綿馬貫眾素ABBA標(biāo)準(zhǔn)品含量（ng），X為綿馬貫眾素ABBA標(biāo)準(zhǔn)品峰面積（mAU*s），R2=0.999 9。樣品中綿馬貫眾素ABBA提取液濃度為15.30 mg/mL。

2.2 綿馬貫眾素ABBA提取液對(duì)鐮孢菌的抑制率的影響

綿馬貫眾素ABBA的不同濃度提取液對(duì)鐮孢菌的抑菌作用差異顯著（表1）。當(dāng)綿馬貫眾素ABBA濃度為0.5 mg/mL時(shí)，其對(duì)鐮孢菌的平均抑菌率為71.19%，當(dāng)濃度提高的1.0 mg/mL時(shí)，相應(yīng)的平均抑菌率提高到91.49%。不同鐮孢菌對(duì)綿馬貫眾素ABBA的敏感性有顯著差異（表1），其中以接骨木鐮孢菌對(duì)綿馬貫眾素ABBA敏感性最高，平均抑菌率為88.82%，其次為黃色鐮孢菌，平均抑菌率為82%，茄病鐮孢菌藍(lán)色變種敏感性最低，平均抑菌率為73.98%。

表1 不同濃度綿馬貫眾素ABBA和鐮孢菌雙因素方差分析Table 1 Two-factor analysis of variance of Fusarium spp.and different concentrations

方差分析（表1）亦表明，濃度×鐮孢菌互作顯著。當(dāng)粗莖鱗毛蕨綿馬貫眾素ABBA提取液濃度在0.5 mg/mL水平時(shí)，對(duì)接骨木鐮孢菌的抑制率顯著高于另外3種鐮孢菌抑制率，對(duì)黃色鐮孢菌和燕麥鐮孢菌的抑制率顯著高于茄病鐮孢菌藍(lán)色變種抑制率，抑制率均在61%以上，其中對(duì)接骨木鐮刀菌的抑制率最高，高達(dá)82.4%，對(duì)茄病鐮孢菌藍(lán)色變種的抑制率最低，為61.5%（圖2A）；在1 mg/mL時(shí)，抑制率均在86%以上，其中對(duì)接骨木鐮刀菌的抑制率最高，高達(dá)95.2%，對(duì)茄病鐮孢菌藍(lán)色變種的抑制率最低，為86.4%（圖2B）。由此可見，粗莖鱗毛蕨綿馬貫眾素ABBA對(duì)不同種鐮刀菌有良好的抑制效果，且高濃度的抑菌效果顯著高于低濃度的抑菌效果。

2.3 綿馬貫眾素ABBA提取液對(duì)接骨木鐮孢菌孢子萌發(fā)率的影響

綿馬貫眾素ABBA溶液處理接骨木鐮孢菌的孢子，孢子萌發(fā)受到一定抑制，處理組孢子萌發(fā)率顯著低于無菌水處理的空白對(duì)照（圖3）。在綿馬貫眾素ABBA處理5 h時(shí)，0.1和0.5 mg/mL水平的處理組接骨木鐮孢菌的孢子萌發(fā)率分別為26.97%和5.48%，而此時(shí)對(duì)照組孢子萌發(fā)率為55.33%，對(duì)照組孢子萌發(fā)率是0.1 mg/mL濃度處理組孢子萌發(fā)率2倍多，是0.5 mg/mL濃度處理組孢子萌發(fā)率10倍多。0.1 mg/mL的綿馬貫眾素ABBA溶液不能完全抑制孢子萌發(fā)，而0.5 mg/mL可以有效的抑制孢子萌發(fā)，為5%以下。0.1和0.5 mg/mL的處理組顯示，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，孢子萌發(fā)率不斷增加，但增加幅度小，0.1和0.5 mg/mL的處理組在0～3 h與對(duì)照組相比，抑制孢子萌發(fā)的效果顯著，3 h時(shí)與對(duì)照組相比，孢子萌發(fā)率均低于10.0%，此時(shí)空白對(duì)照組孢子萌發(fā)率已達(dá)到24.1%。因此，0.1 mg/mL綿馬貫眾素ABBA溶液可在一定程度上延緩接骨木鐮孢菌孢子的萌發(fā)，而0.5 mg/mL綿馬貫眾素ABBA溶液可有效抑制其孢子的萌發(fā)。

2.4 綿馬貫眾素ABBA提取液對(duì)接骨木鐮孢菌菌絲干重的影響

綿馬貫眾素ABBA溶液處理可以顯著抑制接骨木鐮孢菌菌絲的生長(zhǎng)（圖4）。隨著處理濃度的遞增，菌絲干重降低，且均顯著低于空白對(duì)照。當(dāng)綿馬貫眾素ABBA濃度為0.1 mg/mL時(shí)，菌絲體干重為對(duì)照的67.23%，當(dāng)0.5 mg/mL時(shí)，僅為對(duì)照的31.09%。綿馬貫眾素ABBA是四環(huán)間苯三酚屬多環(huán)間苯三酚，其含有2個(gè)乙酰基和2個(gè)丁酰基，可能綿馬貫眾素ABBA作用于鐮孢菌細(xì)胞壁引起組分的變化，進(jìn)而使其細(xì)胞內(nèi)容物有滲漏，使細(xì)胞消融，從而導(dǎo)致菌絲干重的降低。

3 討論

多種植物提取物具有抑制鐮孢菌的效果，潘翠翠等[22]發(fā)現(xiàn)甘草提取物對(duì)尖孢鐮刀菌有一定抑制效果。李孫洋等[23]認(rèn)為三叉苦（Euodia lepta）對(duì)腐皮鐮刀菌（F.solan）的菌絲生長(zhǎng)有一定抑制作用，但蕨類植物對(duì)鐮孢菌抑制作用研究鮮有報(bào)道。

鱗毛蕨屬植物在全球有450多種植物，其中在中國(guó)約有300多種，而有藥用價(jià)值有20多種，粗莖鱗毛蕨是其中的一種，粗莖鱗毛蕨含有多種化學(xué)成分，這些成分具有多方面的藥理作用。研究顯示其主效成分主要是間苯三酚類化合物，目前已分離間苯三酚類化合物有80多種[24,25]。本文首次將粗莖鱗毛蕨中綿馬貫眾素ABBA應(yīng)用到馬鈴薯干腐病防治方面，為研發(fā)新高效植物源殺菌劑提供了理論基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果表明，在一定程度上粗莖鱗毛蕨中綿馬貫眾素ABBA對(duì)茄腐病鐮孢菌藍(lán)色變種、接骨木鐮孢菌、燕麥鐮孢菌和黃色鐮孢菌起到一定抑制作用。在綿馬貫眾素ABBA同一濃度下，對(duì)接骨木鐮孢菌抑制率顯著優(yōu)于其他3種鐮孢菌，同時(shí)證明其對(duì)綿馬貫眾素ABBA相對(duì)敏感。同時(shí)據(jù)不同國(guó)家報(bào)道的病原菌的優(yōu)勢(shì)種在不同地方有所不同，但報(bào)道接骨木鐮刀菌為主要病原菌的文獻(xiàn)較多[26-28]，同時(shí)也是黑龍江省馬鈴薯干腐病主要致病菌之一。因此，本研究對(duì)接骨木鐮孢菌進(jìn)行了孢子萌發(fā)和菌絲干重的初步研究，結(jié)果表明孢子萌發(fā)隨時(shí)間的延長(zhǎng)，孢子萌發(fā)率緩慢的上升；菌絲干重隨綿馬貫眾素ABBA溶液濃度的升高而降低。馬貫眾素ABBA溶液對(duì)接骨木鐮孢菌的抑菌機(jī)理，還需要后續(xù)通過電導(dǎo)率變化、內(nèi)容物的滲漏情況、菌體細(xì)胞壁組分變化等方面具體研究。本研究結(jié)果顯示，粗莖鱗毛蕨中綿馬貫眾素ABBA對(duì)4種鐮孢菌的抑制率有顯著差異，并證明粗莖鱗毛蕨具有開發(fā)植物源殺菌劑的潛力，為防治馬鈴薯干腐病植物源殺菌劑的研發(fā)提供更科學(xué)和具體的理論基礎(chǔ)。