不同形式生物液加固砂土試驗及機理分析

田志鋒，唐小微，修志龍，薛志佳

(1.海岸與近海工程國家重點實驗室(大連理工大學)，遼寧 大連 116024；2.大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧 大連 116024； 3.長安大學 公路學院，西安 710064)

微生物誘導碳酸鈣(microbially induced carbonate precipitation,MICP)是一種綠色環保的土體加固新技術，其原理為細菌自身代謝產生的酶分解尿素產生碳酸根，在適宜條件下與鈣離子反應生成碳酸鈣，可填充孔隙，產生膠結等.現今，MICP已經被越來越多地應用于各工程領域，如提高砂土強度[1-5]、減輕砂土液化[6-7]、修復混凝土裂縫等[8-9].

巴氏球菌(Sporosarcinapasteurii)是一種具有高脲酶活性的尿素分解菌[10].近年來，關于巴氏球菌菌液提高砂土力學性能的研究取得了很大的成果.Dejong等[11]采用RF加固濕陷性松砂，結果表明，用RF處理松砂可有效提高其初始剪切剛度和極限剪切能力；Cheng等[5]使用RF研究不同環境條件下的MICP加固砂土效果，結果表明，經RF加固的砂土抗剪強度可達2 MPa.還有部分學者在MICP應用中采用US作為目標生物液.如Qabany等[12]在研究膠結液濃度對砂土加固的影響時采用經36 h培養的US作為目標生物液，結果表明，用US處理的砂土滲透性降低20%；Dejong等[13]研究生物膠結砂的工程性質時將培養24 h的US直接注入砂土中，經US處理后，砂的抗剪強度高達3.45 MPa；程曉輝等[6]等利用US對微生物加固砂的動力反應進行研究，證明了采用US處理砂柱可有效提高砂土的抗液化性能.如上所述，US和RF作為MICP目標菌液應用于工程均能產生良好的工程效果.但在大多數研究中對于生物液形式的選用卻是任意的，對于試驗或工程應用中US和RF的選擇沒有可以參考的依據.且在生物加固地基的研究中，大多數研究關注的是砂土經微生物加固后的力學性質演化或力學性能的改善情況，很少關注生物液組成成分對砂土力學性質的影響.然而生物液作為誘導碳酸鈣的關鍵成分，其組成成分對碳酸鈣的產量以及砂柱的加固效果有很大的影響.RF是經過新鮮培養培養基重懸菌體制成的，相比US，RF中有更多的營養物質，然而這些營養物質的添加對RF加固砂柱的效果是否有促進作用更是鮮有報道.此外，制備RF需要用離心機離心US以及新鮮培養基重懸菌體，制備RF的花費幾乎是US的兩倍，實際工程中選用生物液需要兼顧加固效果和經濟性.很明顯，探究新鮮培養基的添加對MICP加固砂土的能力是否有促進作用將會為MICP加固砂土中生物液的選用提供一定的依據，而深入研究不同生物液形式加固砂土的作用機理對MICP加固砂柱方案的優化也是至關重要的.

本文通過系列試驗探究了用新鮮培養基重懸菌體對菌液的尿素水解、MICP和砂土加固能力是否有促進效果.由于經生理鹽水重懸菌體而成的生物液(RS)中除菌體及生理鹽水不含其他物質，且生理鹽水只起維持菌體存活的作用，選用RS代表US中的菌體以研究生物液各組分(菌體，SS)的脲酶活性、MICP能力及砂土加固作用機理，為MICP應用于巖土工程時對生物液的選用提供指導.

1 試 驗

1.1 試驗材料

1.1.1 微生物

本文所用菌種為巴氏球菌(S.pasteurii，BNCC136654).培養基由20 g/L酪蛋白胨、5 g/L大豆蛋白胨、5 g/LNaCl和20 g/L尿素組成.細菌在30 ℃、180～200 r/min搖床中培養24 h后分成3份，其中一份不做任何處理(US)，剩余菌液經10 000 r/min離心5 min后分離上清液(SS)及菌體沉淀，并分別用生理鹽水和新鮮培養基重懸，得RS和RF.US的OD600(菌液濃度)為5.72，由于RS和RF含有US的所有菌體，認為三者菌量相等，SS中不含菌體.

1.1.2 反應底物及砂

尿素分解試驗中的反應底物為0.5 mol/L尿素溶液；MICP試驗中，為避免鈣離子不足，用0.5 mol/L Ca(NO3)2·6H2O及0.3 mol/L尿素作反應底物；砂柱試驗用0.5 mol/L Ca(NO3)2·6H2O及0.5 mol/L的尿素作反應液.砂柱試驗用砂為中國福建標準砂，具體參數如表1所示，級配曲線如圖1所示.

表1 砂土參數

圖1 砂土級配曲線

1.1.3 砂柱裝置

用有機玻璃筒(內徑80 mm, 壁厚10 mm，高140 mm)作砂柱試驗的試樣筒.試樣裝置上端開口，下端封閉，下蓋的中心部位開一孔并與硅膠軟管相連，以便注入液能從下口順利流出，并用一個收集器收集流出液.具體裝置見圖2.

1.2 試驗方法

1.2.1 脲酶活性試驗

菌液在1.1所述的培養條件下于250 mL的搖瓶中進行培養，每隔一定時間取3個搖瓶(3組平行試驗)于20 ℃環境中測定OD600，并制備US、RF、RS和SS.然后用電導率法[14]測各菌液的脲酶活性.

圖2 砂柱試驗裝置示意

1.2.2 MICP試驗

分別取4 mL各生物液與24 mL反應液混合后靜置于30 ℃恒溫空氣培養箱中，反應容器為一次性培養皿.定期取樣測尿素濃度及pH.試驗結束后用蒸餾水沖洗沉淀2～3次，并置于60 ℃烘箱，24 h后稱重.碳酸鈣產量計算公式為

mc=mt-mm-ml.

(1)

式中：mc為生成碳酸鈣質量，mt為烘干后總質量，mm為培養皿質量，ml為濾紙質量.

1.2.3 砂柱試驗

砂柱裝樣分3層進行，每層均通過振動密實至目標高度并通水飽和.砂土干密度為1.883 g/cm3，菌液濃度為5.13(OD600).通過表面滲流方式注漿.將1.5倍孔隙體積的各生物液分別注入砂柱后停歇8 h，然后將2倍孔隙體積反應液注入砂柱，并停歇4 h，共循環注入6次.注漿完成后將砂柱分成3份，采用直剪試驗測定抗剪強度.直剪試驗采用50 kPa上覆壓力，加載速率為2 mm/min.測量完成后用差量-酸洗法[14]測定碳酸鈣產量并用掃描電子顯微鏡(SEM)探究生物加固砂的微觀結構.

2 結果與討論

2.1 不同生長階段菌液的脲酶活性

細菌的生長曲線如圖3所示.細菌在0～15 h處于增長期，之后進入穩定期，菌量不再增加.不同生長階段菌液的脲酶活性如圖4(a)所示，其中脲酶活性表示為溶液中單位時間(min)內尿素濃度的降低量.所有菌液的脲酶活性均隨培養進行而逐漸增大.培養15 h后，菌量不再增加，但脲酶活性仍繼續增加，表明盡管處于穩定期，細菌仍有產脲酶的能力.穩定期時RS脲酶活性的升高同樣證明了處于穩定期的菌體仍可繼續產脲酶.此外，穩定期時RS的脲酶活性小于RF，說明新鮮培養基的添加能提高菌體的尿素分解能力.然而，如圖4(a)所示，初始階段US的脲酶活性低于RF，但當培養時間超過12 h時US的脲酶活性反而大于RF.初步認為，一方面培養初期，菌液濃度相對較低，新鮮培養基對菌體代謝有較大促進作用，隨著細菌濃度的增加，新鮮培養基對菌體脲酶活性的促進作用逐漸減弱.另一方面，SS的脲酶活性很低，但并不為零(圖4(a)所示)，說明SS中含有一定量的脲酶.根據Kantzas等[15]的研究，脲酶屬于胞內酶，但也會隨細胞的死亡裂解而釋放于體外.在制備RF時去除了SS，導致其損失了SS中的脲酶，該部分脲酶一定程度上抵消了新鮮培養基對菌體脲酶活性的促進，最終導致穩定期時US的脲酶活性大于RF.

圖3 巴氏球菌生長曲線

由于RF、RS和SS均由US制備，其菌量相同，而SS也是來源于US，其中的游離脲酶為US中部分菌體裂解釋放所得，因此，本文中4種生物液的單位脲酶活性定義為單位菌量的脲酶活性，其中所有菌液類型均以US的OD600作為總菌量.圖4(b)表明，所有生物液的單位脲酶活性均先短暫增加后逐漸降低，在3 h時達到最大值.Zhao[16]在研究巴氏球菌脲酶活性時也發現，菌液在培養初期先達到最大脲酶活性之后逐漸降低.3 h時單位脲酶活性最大，但菌量極少，細菌的總脲酶活性反而較低.因此，實際工程中可采用具有較高脲酶活性的穩定期菌液作為目標生物液.

2.2 生物液誘導生成碳酸鈣沉淀能力

MICP試驗結果如圖5所示.RF和RS的碳酸鈣產量均在6 h時基本達到穩定，但RS略低于RF，表明新鮮培養基的添加增加了RF中的菌體誘導生成碳酸鈣的能力.由于RF中有新鮮培養基的添加，其菌體誘導碳酸鈣能力應大于US，但如圖5所示，US誘導的碳酸鈣產量略高于RF，這主要是由于制備RF時SS的損失.對于RF，新鮮培養基對菌體的重懸增加了菌體誘導碳酸鈣的能力，但其制備時損失了SS中存在的脲酶及原有尿素分解物，導致其最終碳酸鈣產量反而比US少.

圖4 處于不同生長時期的生物液的尿素分解能力

圖5 不同生物液類型誘導生成碳酸鈣沉淀產量

此外，US由RS中的菌體和SS兩部分組成，因此，對比了US的碳酸鈣產量與RS和SS的總碳酸鈣產量(圖5).結果表明，US的碳酸鈣產量略低于RS與SS碳酸鈣產量之和.US中存在部分菌體的裂解死亡，菌體數量減小，而RS中的生理鹽水維持細菌存活，其菌體數量相對US較多，提供了更多的成核位置，導致其碳酸鈣產量大于US.

碳酸鈣產率定義為碳酸鈣實際生成量與理論生成量比值，反映MICP的效率.碳酸鈣理論生成量按所有尿素完全分解且完全轉化計算.由于其溶解度非常小(25 ℃時，KP,calcite=3.098 8-9(mol-2·L-2))[17]，忽略碳酸鈣溶解對實測生成量的影響.碳酸鈣產率為

(2)

式中：ECaCO3(s)為碳酸鈣產率，mCaCO3(s)為實測生成量，mCaCO3(T)為理論生成量.

如圖6所示，RF、US、RS和SS誘導生成碳酸鈣的最高產率分別為93.1%、92.8%、63%、34%.其中RF碳酸鈣產率的計算基準是尿素含量. RF去除了SS，即其理論生成量不含SS中尿素分解物對應的碳酸鈣產量，因此，雖其碳酸鈣產量不如US，但產率略大于US.在MICP中，碳酸鈣產率不僅受尿素、碳酸根和鈣離子含量的限制，還受成核位點、pH等的影響.如圖7(a)所示，雖然各組的pH不斷波動，但基本處于8.8～9.1，而該pH對巴氏球菌的活性基本無影響.Okwadha等[18]的MICP試驗中pH基本穩定在9左右，與細菌濃度無關.而Stocks等[19]證明碳酸鈣在pH為8.3時開始析出，在pH為9時基本完成.MICP過程中的尿素濃度(圖7(b))表明，所有生物液誘導碳酸鈣的產率均未達100%，主要是尿素水解不完全所致.在MICP過程中，微生物為碳酸鈣的形成提供成核位點，隨著碳酸鈣不斷形成，菌體逐漸被包裹，失去脲酶活性，最終限制了尿素水解和碳酸鈣生成[20].

圖6 不同生物液類型誘導生成碳酸鈣沉淀產率

MICP試驗表明高濃度菌體誘導形成碳酸鈣的速度很快，在該實驗條件下，對US和RF來說，6 h即可達到90%以上的碳酸鈣產率.此外，生物誘導形成的碳酸鈣在6～60 h時基本沒有變化，表明碳酸鈣可長期處于穩定狀態.

2.3 碳酸鈣形態分析

由圖8可以看出，不同形式生物液誘導生成的碳酸鈣形態之間有明顯差異.US誘導生成的碳酸鈣幾乎全部膠結于培養皿上，RF組的碳酸鈣部分則膠結于培養皿底板(箭頭A).RS雖含有大量的菌體，但其生成的碳酸鈣在培養皿上基本無膠結，而主要以絮凝狀形式(箭頭C所示)懸浮于溶液中.造成該差異的具體原因還有待研究，但可能與生理鹽水有關.SS誘導生成的碳酸鈣主要為單顆粒，基本上自由懸浮于溶液中(D，E所示).值得注意的是，US誘導的碳酸鈣在培養皿上的完全膠結證明了其更強的膠結能力.而相比其他3種生物液，US誘導生成碳酸鈣更強的膠結能力，一定程度上提高了US加固砂柱效果.而RF誘導的碳酸鈣部分黏結于培養皿底板則反映了其相對較弱的膠結能力.

2.4 砂柱強度及碳酸鈣產量

砂柱試驗研究了不同形式生物液加固砂土的效果.未加固砂及加固后各砂柱的抗剪強度如圖9所示.其中未加固砂的抗剪強度為17.2 kPa，相比未加固砂，所有經生物液加固的砂柱的抗剪強度均有明顯的提高.剪切強度提高最高可達16.6倍(US最高剪切強度284.8 kPa)，最小的也提高了3.6倍(SS最低剪切強度61.3 kPa).經US加固的砂柱除底部抗剪強度略低外，其頂部和中部的抗剪強度均高于其他3種生物液加固砂的抗剪強度.RF經新鮮培養基重懸，增加了更多的營養物質，但其處理砂柱的強度反而略低.雖然不能達到含菌生物液(US、RS、RF)對砂柱的加固效果，SS加固砂的抗剪強度也明顯增加.此外，所有砂柱的抗剪強度均表現為上部最大，下部次之，中間最小.

砂柱中的碳酸鈣產量如圖10所示.碳酸鈣產量與砂柱抗剪強度具有相同的分布趨勢，同樣表現為US加固砂的碳酸鈣產量最大，RF次之，SS最小，且沿著注入方向碳酸鈣產量先減小后增加.在砂土中，碳酸鈣膠結于砂粒表面或沉積于砂粒間孔隙內，在砂粒間產生嵌固及膠結作用，增加砂土的結構性，提高其抗剪強度[3].根據Michael[4]與Cheng等[5]的結論，碳酸鈣產量和抗剪強度之間呈正相關，相同條件下，碳酸鈣產量越大，抗剪強度越大.根據Barkouki[21]的研究，碳酸鈣產量沿注入方向越來越少.由于本文試驗采用表面滲透方式注漿，且砂柱底部有溶液緩沖盒，菌液易在其表面聚集并生成碳酸鈣，導致砂柱下部碳酸鈣產量及抗剪強度比中部大.

圖10 砂柱中碳酸鈣產量

圖11展示了不同生物液加固砂柱的強度與碳酸鈣產量之間的關系.可明顯得出無論何種生物液類型，砂柱的抗剪強度均隨著碳酸鈣產量的增加呈指數型增長.但對于不同生物液，相同碳酸鈣產量對應的砂土加固效果差別很大，即不同生物液在砂土中產生的有效膠結大不相同.微生物誘導碳酸鈣在土中有兩種存在形式，即包覆砂粒和填充孔隙.當菌體存在時，菌體吸附于砂粒表面或砂粒接觸處，為碳酸鹽的產生和疊合提供成核位點.在成核位點存在時，碳酸鈣主要在細菌周圍聚集，膠附于砂粒上或砂粒接觸處，因此，含菌體的生物液誘導生成的碳酸鈣多覆于砂粒表面，主要為膠結作用.如3.3節所述，SS誘導生成碳酸鈣沉淀主要是由于碳酸鈣的過飽和.對于SS，在沒有細菌提供成核位點情況下，生成的非生物碳酸鈣主要是填充孔隙，起到嵌合作用，膠結較少，因此，砂粒間有效膠結接觸也較少，相同碳酸鈣含量時，砂土抗剪強度相對較低.對于RF，基本不存在非生物碳酸鈣的生成，填充作用較少，在低碳酸鈣含量時，生成的碳酸鈣優先包裹砂粒，因此，形成砂粒間有效膠結接觸需要更多的碳酸鈣.當砂粒被包裹到一定程度，砂顆粒之間的嵌合和膠結越來越多，之后隨著碳酸鈣的增加，MICP引起的有效接觸增加越來越快，相同碳酸鈣產量下，其強度也更大.US不僅包含菌體，還含有SS，其在砂柱中生成的碳酸鈣既有主要用于膠結砂粒的生物碳酸鈣，也有主要用于填充孔隙的非生物碳酸鈣.當碳酸鈣產量相同時，嵌合作用和膠結作用的同時存在使砂粒間產生更多的有效膠結接觸，導致更大的抗剪強度.

圖11 碳酸鈣產量與砂柱抗剪強度關系

圖12(a)和(b)分別顯示了US和RF的SEM圖，從中可清楚地看到，US加固砂中的碳酸鈣大量聚集在砂顆粒連接處，而RF加固砂中，砂顆粒連接處之間的碳酸鈣相對較少.相比RF，US中多了SS，且SS中無菌體，其中存在菌液培養時期尿素分解所產生的碳酸根以及部分脲酶，在鈣離子存在時，這部分碳酸根及部分脲酶分解尿素生成的碳酸根在無成核位置的情況下，最終導致US加固砂柱中分布于土顆粒間(空隙處)的碳酸鈣比RF多.

圖12 不同微生物加固砂的SEM圖

2.5 經濟及工程適用性

如1.1節所述，RF是在US的基礎上做了進一步的處理，其首先要用離心機對US進行離心，之后需要用與初始培養基等量的新鮮培養基對離心獲得的菌體進行重懸.實際工程中，相比US，制備RF需要額外的離心設備以及兩倍的培養基量，因此，其制備成本也是RS兩倍之多.

根據實驗結果，在本文的砂柱處理時長下，原菌液(US)對砂柱的加固效果要優于新鮮培養基重懸菌體(RF)的加固效果.需要指出的是，新鮮培養基對菌體的重懸一定程度上為細菌的存活性和再繁殖提供了更好的營養條件，增加了菌液的長期存活性.當MICP應用于強度要求更高、處理時間更長的地基工程時，新鮮培養基對細菌作用時長的延長或許間接節省成本，提高工程效果，但還需要進一步的研究.而對強度要求一般且需要快速加固的地基，采用US作為目標菌液則更經濟、高效.

3 結 論

1)用新鮮培養基對菌體重懸可促進菌體的尿素分解能力，當菌液濃度較低時(培養時間少于12 h)，菌體尿素分解能力的提高大于RF制備時由于去除SS引起的菌液尿素分解能力的削弱，導致RF的尿素分解能力大于US，當菌液濃度較高時，US的尿素分解能力大于RF.

2)處于穩定期的細菌仍有繼續產脲酶的能力.US分解尿素的能力來源于兩方面，即菌體內脲酶和細胞裂解死亡釋放到體外的脲酶，其中菌體內脲酶占大部分.

3)新鮮培養基的添加明顯提高了菌體的MICP能力，但SS的損失導致RF的MICP能力與US基本相同(RF和US誘導生成碳酸鈣的產率分別為93.1%和92.8%).此外碳酸鈣產量在6 h達到穩定后，未隨時間增加逐漸減小，可長期處于穩定狀態.

4)US加固的砂柱具有更高的抗剪強度及碳酸鈣產量，SS雖未含菌體，也可誘導生成碳酸鈣并具有加固砂土的能力.

5)同種形式生物液，砂柱的抗剪強度隨碳酸鈣產量的增加而增加；不同形式的生物液，相同碳酸鈣產量時，US的抗剪強度最大，主要是因為US 中SS和菌體的同時存在使砂柱中既產生主要起填充孔隙作用的非生物碳酸鈣，又產生主要起膠結作用、包裹砂粒的生物碳酸鈣，兩者共同作用導致了更有效的膠結接觸.