HPLC法同時(shí)測(cè)定清瘟解毒口服液中梔子苷、黃芩苷的含量

龔旭昊，楊星，張璐，趙富華，范強(qiáng)

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

清瘟解毒口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)收載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(2017年版中藥卷)》中，其由地黃、梔子、黃芩、連翹、玄參、板藍(lán)根6味中藥經(jīng)現(xiàn)代提取工藝加工而成[1]。方中用黃芩清瀉肺熱，連翹清心經(jīng)客火，板藍(lán)根利咽解毒，三者共為君藥，清解中上焦氣分實(shí)熱；梔子清三焦火熱為臣藥，輔助君藥瀉火敗毒；地黃、玄參涼血滋陰降火皆入腎經(jīng)，為佐使藥；諸藥合用，共奏清熱瀉火、益陰敗毒之功[2]。臨床上主治外感發(fā)熱，在家禽病毒病的防控中應(yīng)用十分廣泛，系國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中清熱解毒類代表性方劑之一[3]。

該方劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只采用薄層色譜法對(duì)黃芩、梔子、連翹進(jìn)行定性檢測(cè)，不能完全反映處方情況，質(zhì)控水平較低，缺乏主要藥效成分的定量測(cè)定，不利于產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性控制和質(zhì)量評(píng)價(jià)，可能導(dǎo)致較為嚴(yán)重的產(chǎn)品臨床療效差異。基于以上分析，本研究參考《中國(guó)獸藥典》2015年版二部龍膽瀉肝散及相關(guān)文獻(xiàn)[4-5]，選擇方中君藥黃芩、臣藥梔子中指標(biāo)活性成分黃芩苷、梔子苷為研究對(duì)象，建立同時(shí)測(cè)定二者含量的高效液相色譜方法，為清瘟解毒口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善及產(chǎn)品質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 儀器：Waters e2695高效液相色譜儀，配置Waters 2998 PDA檢測(cè)器，Empower3色譜工作站軟件。分析天平(Mettler XS205，十萬分之一)，昆山KQ-300型超聲波清洗器。試劑：乙腈，色譜純，購自默克公司；甲醇，分析純，購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸，分析純，購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水由實(shí)驗(yàn)室MILLIPORE超純水儀自制。

1.2 試藥 梔子苷對(duì)照品(批號(hào)：110749-201718)，97.6%，中國(guó)食品藥品檢定研究院；黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)：Z0271705)，96.8%，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。供試品：某企業(yè)生產(chǎn)的清瘟解毒口服液，批號(hào)：18010201；陰性對(duì)照供試品：根據(jù)清瘟解毒口服液處方組成，取處方中除梔子、黃芩以外的其他藥味，照其制備工藝[1]，由實(shí)驗(yàn)室自制而成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Shiseido MGⅡC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，編號(hào)：A4AD06200；流動(dòng)相：以0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫，見表1。柱溫：25 ℃，流速：1.0 mL/min；二極管陣列檢測(cè)器，采集波長(zhǎng)范圍為210～400 nm，分辨率為1.2 nm，記錄238 nm波長(zhǎng)處的色譜圖。

表1 梯度洗脫表Tab 1 Gradient elution form

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 取梔子苷對(duì)照品25.0 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為梔子苷對(duì)照品儲(chǔ)備液；取黃芩苷對(duì)照品25.0 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取梔子苷對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL、黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液10 mL，至同一50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為梔子苷50 μg/mL和黃芩苷100 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備 精密量取清瘟解毒口服液供試品1 mL，置50 mL量瓶中，加50%甲醇40 mL，超聲處理10 min，放置至室溫，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.4 陰性對(duì)照溶液的制備 精密量取陰性對(duì)照供試品1 mL，同1.3.3項(xiàng)下方法，制備得陰性對(duì)照溶液。

1.3.5 測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品混合溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果 為考察方法的專屬性，即判斷空白溶劑、制劑中各化學(xué)成分及輔料對(duì)梔子苷、黃芩苷的測(cè)定是否存在干擾，分別精密吸取空白溶劑(50%甲醇)、對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，照1.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖與光譜圖。結(jié)果顯示，對(duì)照品溶液中梔子苷和黃芩苷的保留時(shí)間分別為8.008 min、33.601 min；供試品中梔子苷、黃芩苷與相應(yīng)的對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間及光譜圖均一致，且均達(dá)到基線分離；空白溶劑和陰性對(duì)照溶液色譜圖中，在梔子苷和黃芩苷出峰處均沒有干擾，表明其他成分對(duì)二者的測(cè)定均不會(huì)造成影響。結(jié)果見圖1～圖4。

圖1 空白溶劑色譜圖Fig 1 Chromatogram of blank solvent

圖2 對(duì)照品溶液色譜圖Fig 2 Chromatogram of control solution

圖3 陰性對(duì)照溶液色譜圖Fig 3 Chromatogram of negative control solution

圖4 供試品溶液色譜圖Fig 4 Chromatogram of test solution

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察 精密稱取梔子苷、黃芩苷對(duì)照品適量，置量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別制成梔子苷濃度依次為5、15、25、50、100、200、250 μg/mL，黃芩苷濃度依次為10、30、50、100、200、400、500 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，濾過，分別進(jìn)樣10 μL，照1.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得梔子苷、黃芩苷回歸方程分別為(n=7)：Y=14614X+35809，R2=0.9999；Y=13270x+23503，R2=1.00。結(jié)果表明，梔子苷濃度在5 μg/mL～250 μg/mL、黃芩苷濃度在10 μg/mL～500 μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與溶液濃度線性關(guān)系良好。見表2。

表2 線性關(guān)系考察Tab 2 Investigation of linear relations

2.2.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取清瘟解毒口服液供試品，根據(jù)1.3.3項(xiàng)下方法平行配制6份供試品溶液，照1.3.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果梔子苷、黃芩苷平均含量分別為5.49、4.36 mg/mL，RSD分別為0.42%、0.60%，表明方法重復(fù)性良好，見表3。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液，照1.3.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，結(jié)果連續(xù)進(jìn)樣6次梔子苷、黃芩苷峰面積的RSD分別為0.22%、0.36%，表明方法精密度良好，見表4。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)Tab 3 Repeatability test

表4 精密度試驗(yàn)Tab 4 Precision test

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，照1.3.1項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、6、12、24、48 h各進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測(cè)定，記錄梔子苷、黃芩苷的峰面積，其RSD分別為0.30%、0.56%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，見表5。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)Tab 5 Stability test

2.2.5 回收率試驗(yàn) 根據(jù)清瘟解毒口服液供試品中梔子苷和黃芩苷含量，按照供試品、對(duì)照品量各半的方法，精密添加梔子苷和黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液，平行制備6份樣品，照1.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，梔子苷的回收率在98.99%～100.96%之間，平均回收率為100.14%，RSD值為0.87%；黃芩苷的回收率在98.01%～100.40%之間，平均回收率為99.42%，RSD值為0.94%，表明方法回收率良好，符合要求，見表6。

表6 回收率試驗(yàn)Tab 6 Recovery test

2.2.6 檢測(cè)限與定量限 分別精密量取1 mL陰性對(duì)照供試品置50 mL量瓶中，再精密吸取1.3.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5、1、1.5、2 mL加入相應(yīng)量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，照1.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。按照3倍噪音計(jì)算檢測(cè)限濃度，并參考紫外吸收光譜圖進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。梔子苷、黃芩苷的檢測(cè)限濃度分別為0.5、1.0 μg/mL，S/N值均為4.5；按照10倍噪音計(jì)算定量限濃度，梔子苷、黃芩苷的定量限濃度分別為1.0、2.0 μg/mL，S/N值分別為15.6、11.9。

2.2.7 耐用性試驗(yàn) 分別從色譜柱類型和柱溫對(duì)方法的耐用性進(jìn)行考察。

2.2.7.1 色譜柱類型考核 取清瘟解毒口服液供試品溶液，照1.3.1項(xiàng)下色譜條件，分別考察Waters SunFire C18(4.6 mm×250 mm，5 μm；S.N：01623329013880)，Shiseido MGⅡ C18(4.6 mm×250 mm，5 μm；S.N：A4AD06200)，Dikma C18(4.6 mm×250 mm，5 μm；S.N：6012835)，Grace Apollo C18(4.6×250 mm，5 μm；S.N：210100396)對(duì)兩種被測(cè)成分保留時(shí)間、分離度、拖尾因子、理論塔板數(shù)的影響。結(jié)果見表7。

表7 色譜柱類型考察Tab 7 Investigation of chromatographic column types

2.2.7.2 色譜柱柱溫考察 取清瘟解毒口服液供試品溶液，改變色譜柱柱溫分別在20 ℃、25 ℃、30 ℃進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，隨柱溫升高，梔子苷和黃芩苷保留時(shí)間有所提前，但峰面積、分離度、拖尾因子、理論塔板數(shù)基本沒有變化。

上述耐用性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法耐用性良好。

2.3 樣品含量測(cè)定 為摸排市場(chǎng)現(xiàn)有清瘟解毒口服液的質(zhì)量差異，進(jìn)而為產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供科學(xué)依據(jù)。照1.3.1項(xiàng)下色譜條件，本次研究共對(duì)來自河南、山東、江蘇等8家獸藥企業(yè)的8批樣品及實(shí)驗(yàn)室自制的1批樣品進(jìn)行了梔子苷、黃芩苷含量的測(cè)定。結(jié)果顯示，一是本實(shí)驗(yàn)研究所建立的HPLC含量測(cè)定方法可行，適用于不同廠家產(chǎn)品中兩種成分的同時(shí)測(cè)定；二是不同廠家的產(chǎn)品質(zhì)量差異較大，在9批樣品中，梔子苷含量范圍為0.39 mg/mL～12.48 mg/mL，最大相差32倍；黃芩苷含量范圍為1.11～18.91 mg/mL，最大相差17倍；見表8。該結(jié)果表明，不同廠家的工藝水準(zhǔn)、質(zhì)控水平參差不齊，或?qū)е庐a(chǎn)品質(zhì)量及臨床療效存在嚴(yán)重差異。基于此，完善清瘟解毒口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)極為必要。

表8 樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab 8 Determination results of sample content

3 討論與結(jié)論

3.1 提取溶劑考察 根據(jù)獸藥典及文獻(xiàn)相關(guān)方法，試驗(yàn)分別考察了水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇的提取效率。即精密量取供試品1 mL置50 mL量瓶中，分別加入水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇40 mL，超聲30分鐘，放置至室溫，再加相應(yīng)溶劑稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試品中黃芩苷在50%甲醇中的提取效果優(yōu)于其他溶劑，最終選擇50%甲醇為供試品提取溶劑。

3.2 提取方式考察 精密量取供試品1 mL置50 mL量瓶中，加50%甲醇40 mL，分別采取不超聲直接稀釋至刻度并振搖，超聲10 min、超聲20 min、超聲30 min后放置至室溫并稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果上述四種提取方式所得梔子苷峰面積RSD為0.18%，黃芩苷RSD為0.28%，均小于2%。該結(jié)果表明，振搖和超聲的提取效率基本相同，為確保供試品溶液混合均勻，兼顧測(cè)定效率，最終選擇超聲10 min作為供試品提取方式。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 試驗(yàn)中，在210～400 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)梔子苷、黃芩苷的最大吸收波長(zhǎng)進(jìn)行掃描。其中，黃芩苷的特征吸收在278 nm，梔子苷的特征吸收在238 nm。經(jīng)試驗(yàn)考察，發(fā)現(xiàn)在278 nm波長(zhǎng)處，梔子苷幾乎無響應(yīng)值，而在238 nm處，黃芩苷仍有較為明顯的特征峰，故最終將檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定在238 nm。

3.4 流動(dòng)相的選擇 本試驗(yàn)在參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]和《中國(guó)獸藥典》2015年版二部龍膽瀉肝散含量測(cè)定的基礎(chǔ)上，分別考察了“甲醇/乙腈-水”、“甲醇-磷酸水溶液”、“乙腈-磷酸水溶液”洗脫系統(tǒng)，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用“甲醇/乙腈-水”作為流動(dòng)相，基線分離效果較差；“甲醇-磷酸水溶液”作為流動(dòng)相，柱壓較高；而乙腈洗脫能力優(yōu)于甲醇，且在流動(dòng)相中加入少量磷酸可以起到改善峰形和分離度、減少拖尾的效果。故最終選擇“乙腈-0.2%磷酸水溶液”作為本含量測(cè)定方法流動(dòng)相。

3.5 結(jié)論 隨著我國(guó)集約化規(guī)模化養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，以及社會(huì)公眾對(duì)動(dòng)物源性食品中獸藥殘留的擔(dān)憂，中獸藥因其綠色天然、毒副作用低、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)在獸醫(yī)臨床中的使用日益廣泛[7]。伴隨中獸藥廣泛應(yīng)用而來的是其質(zhì)量控制問題日益突出，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究與制定，對(duì)生產(chǎn)實(shí)際及臨床療效的影響越來越大。因此，質(zhì)控問題及研究也是決定中獸藥產(chǎn)業(yè)能否實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代化和國(guó)際化的重要前提。基于此，提高中獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并建立完善的質(zhì)控體系，不僅是為養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)提供質(zhì)量可控、成份明確及品質(zhì)穩(wěn)定的產(chǎn)品，也是推動(dòng)行業(yè)健康發(fā)展的需要[8]。

作為清瘟解毒類的代表性方劑，清瘟解毒口服液現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)缺乏對(duì)主要活性成分的含量監(jiān)測(cè)，已經(jīng)無法對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量和臨床療效進(jìn)行有效控制。本研究選取方中主要藥味黃芩、梔子中的主要活性成分黃芩苷、梔子苷為研究對(duì)象，建立了HPLC同時(shí)對(duì)兩種活性成分進(jìn)行含量測(cè)定的方法。研究結(jié)果顯示，該方法操作簡(jiǎn)單，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精密度、耐用性良好，適用于該制劑的質(zhì)量控制，并為制劑標(biāo)準(zhǔn)的完善和產(chǎn)品療效的有效控制提供了科學(xué)依據(jù)。