枸杞發酵飲料的工藝優化及其風味物質分析

汪云陽，單靜博，陳亞楠，喬長晟，羅學剛，*

（1.工業發酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津300457；2.天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心，天津300457；3.天津慧智百川生物工程有限公司，天津300457）

枸杞作為傳統中藥材和功能性食品，在中國已有2 000多年的歷史[1-2]。枸杞果實是一種“藥食同源”的保健性食品，其色澤鮮紅，口感酸甜[3]，被認為具有不同的藥理活性和保健作用，廣泛應用于不同的方劑和中成藥中[4]。當前科學研究表明，枸杞果實中含有豐富的營養物質，主要涉及多糖、多肽、生物堿、黃酮類、萜烯類、有機酸、木脂素、酚酰胺、類胡蘿卜素等多種化合物[5-7]，而多糖是枸杞果實中含量最豐富的活性成分。現代藥理研究表明枸杞果實中的多糖具有抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤、抗輻射、抗氧化、補肝益腎、補血安神等諸多藥用功效[5，8-9]。

益生菌是一類對宿主有益的活性微生物，現代研究結果表明，益生菌進入并定植在胃腸道后，能夠與宿主共生，從而構成一個復雜的微生態環境，對宿主發揮其益生作用，例如改善腸道菌群結構，維持腸道的微生態平衡，提高宿主的免疫力[10]。在評估益生菌特性的乳酸桿菌物種中，植物乳桿菌被認為是一種高度通用的物種，對維護人體健康十分重要[11-12]。相關研究證實，植物乳桿菌CGMCC8198（L.plantarum CGMCC8198）具有很好的耐酸耐膽鹽能力，可以調節胃腸道功能，降低因高脂飲食所造成的肥胖及高血脂病變，有效預防動脈粥樣硬化的發生[13-15]。

目前，枸杞的使用已經擴展到所有西方國家，人們食用枸杞果實，并將枸杞果實的濃縮果汁或提取物添加到飲料中，以期改善肝功能和氧化應激損傷[16-17]。由于枸杞自身并沒有突出的香味，并且藥味濃重，無較佳的風味，因此單獨使用枸杞為原料生產的枸杞原漿口感欠佳，這種情況嚴重地影響了枸杞類飲品的生產和市場開發[18]。有研究表明益生菌枸杞發酵飲料具有潛在的益生菌活菌特有的生理功能，可以調理腸道菌群，是一種理想的集天然、營養、滋補于一體的保健飲品，有廣泛的市場前景[19]。因此本文采用L.plantarum CGMCC8198對枸杞原漿進行單一菌種定向發酵，在較大程度保持營養物質的同時，生產出風味獨特、口感優良的枸杞發酵飲料，又進一步分析了枸杞汁發酵前后風味物質種類及含量的變化，為枸杞發酵飲料的工業化生產提供最佳工藝參數。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞原漿：天津慧智百川生物工程有限公司；L.plantarum CGMCC8198：天津科技大學生物工程學院微生態調控與分子藥理學實驗室保存；碳酸氫鈉、木糖醇：市售食品級；葡萄糖、亞鐵氰化鉀、硫酸銅、次甲基藍、氫氧化鈉：天津泰進科技有限公司。

1.2 儀器與設備

4R2204CN型電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；TG16B型高速臺式離心機：湖南凱達科學儀器有限公司；LRH-150型生化培養箱：上海齊欣科學儀器有限公司；PSSJ-4V型精密pH計：上海精密科學儀器公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；57330-U型固相微萃取裝置、50/30 μm DVB/CAR/DVB固相微萃取針、手動SPME進樣器：美國Suplco公司；安捷倫5975C+7890A氣相色譜-質譜聯用儀：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵工藝流程

發酵工藝流程圖見圖1。

圖1 發酵工藝流程圖Fig.1 Fermentation process flow diagram

1.3.2 枸杞發酵飲料的感官評定標準

感官評定小組成員通過篩選確定，由8位食品專業相關人員組成。感官評價細則見表1，分別從色澤、香氣、口感、狀態4個方面對枸杞發酵飲料進行評分，總分100分。

表1 枸杞發酵飲料感官評價標準Table 1 Wolfberry fermented beverage sensory evaluation criteria

1.3.3 枸杞發酵飲料的單因素試驗

以枸杞原漿與水的體積比8∶1、發酵時間8 h、發酵溫度33℃，木糖醇添加量5%，接種量3%為基礎發酵條件，以體積比（4 ∶1、6 ∶1、8 ∶1、10 ∶1、12 ∶1）、發酵時間（4、6、8、10、12 h）、發酵溫度（29、31、33、35、37 ℃）、木糖醇添加量（1%、3%、5%、7%、9%）、植物乳桿菌CGMCC8198接種量（1%、2%、3%、4%、5%）為變量進行單因素試驗，考察各個因素對枸杞發酵飲料感官品質的影響。

1.3.4 枸杞發酵飲料的響應面設計

選取單因素試驗確定的各因素的較優值，以感官評分為響應值，采用Design-Expert.V8.0.6響應面設計軟件，根據Box-Behnken設計中心試驗設計原理設計四因素三水平的試驗，具體因素水平見表2。

表2 Box-Behnken設計因素水平表Table 2 Box-Behnken design level of form factors

1.3.5 測定枸杞發酵飲料的條件

采用頂空固相微萃取-氣質聯用分析（head spacesolid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技術測定枸杞發酵飲料的條件。

1.3.5.1 頂空固相微萃取條件

吸取6mL樣品置于樣品瓶中，同時加入適量NaCl使其達到飽和狀態，將樣品瓶置于60℃的水浴條件下平衡15 min，再插入萃取頭吸附45 min。

1.3.5.2 色譜條件

采用不分流進樣方式，進行階段升溫，以初始溫度60℃保持續2 min，再以5℃/min升至160℃保持1 min，接著以10℃/min升溫至250℃保持4 min[20]。

1.3.5.3 質譜條件

信號采集使用全掃描的方式進行，離子源溫度設置為230℃，四級桿溫度設置為150℃。電子能量為70 eV，檢測電壓350 V。結果經過計算機檢索后與NIST普庫進行比對，選取匹配度大于90%的化合物，鑒定主要化合物的種類及其物質相對含量。

1.3.6 理化指標

pH值：用PSSJ-4V型精密pH計測定；還原糖含量測定：按照直接滴定法測定[21]。

1.3.7 微生物指標

參照GB 4789.35-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》進行乳酸菌計數。

1.3.8 數據分析

采用GraphPad Prism 5軟件、Design-Expert.V8.0.6響應面分析軟件和Excel進行數據的處理和分析。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 體積比對枸杞汁發酵的影響

體積比對發酵枸杞汁飲料感官評分的影響見圖2。

圖2 體積比對發酵枸杞汁飲料感官評分的影響Fig.2 Effect of ratio of volume on sensory score of fermented oyster sauce and gluten index of the whole wheat flours

由圖2可知，隨著體積比的增加，枸杞發酵飲料的感官評分先上升后又下降，體積比值較低時枸杞風味較淡，體積比過高又會有苦澀感。在體積比為10∶1時，飲料的感官評分最高，因此，體積比為10∶1較為適宜。

2.1.2 發酵時間對枸杞汁發酵的影響

發酵時間對發酵枸杞汁飲料感官評分的影響見圖3。

由圖3可知，當發酵時間6 h時感官評分高達92，之后隨著發酵時間的延長感官評分急速下降。可能由于發酵時間較長，導致飲料過酸，產生不良的風味。因此，發酵時間為6 h較為適宜。

2.1.3 發酵溫度對枸杞汁發酵的影響

發酵溫度對發酵枸杞汁飲料感官評分的影響見圖4。

由圖4可知，隨著發酵溫度的升高，飲料的感官評分先緩慢增加又緩慢降低，當發酵溫度為33℃時，感官評分最高。溫度偏高或偏低不利于菌株的生長，可能導致發酵風味欠佳。因此，適宜的發酵溫度為33℃。

圖3 發酵時間對發酵枸杞汁飲料感官評分的影響Fig.3 Effect of fermentation time on sensory score of fermented oyster sauce

圖4 發酵溫度對發酵枸杞汁飲料感官評分的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on sensory score of fermented oyster sauce

2.1.4 木糖醇添加量對枸杞汁發酵的影響

木糖醇添加量對發酵枸杞汁飲料感官評分的影響見圖5。

由圖5可知，隨著木糖醇的添加量增加，枸杞發酵飲料的感官評分先緩慢增加然后又稍降低。一定量的木糖醇可增加飲料的甜味，過多的量又會造成風味的不協調。當木糖醇的添加量為7%時，枸杞發酵的飲料風味最佳，酸甜適中。因此，較適宜的木糖醇添加量為7%。

2.1.5 接種量對枸杞汁發酵的影響

接種量對發酵枸杞汁飲料感官評分的影響見圖6。

由圖6可知，隨著接種量的增加，飲料的感官評分先增加后又緩慢降低，接種量過多會導致飲料口味偏酸，發酵風味過于濃厚，風味不協調。因此，較適宜的植物乳桿菌CGMCC8198的接種量為2%。

圖5 木糖醇添加量對發酵枸杞汁飲料感官評分的影響Fig.5 Effect of xylitol addition on sensory score of fermented oyster sauce

圖6 接種量對發酵枸杞汁飲料感官評分的影響Fig.6 Effect of inoculum size on sensory score of fermented oyster sauce

2.2 響應面優化分析

2.2.1 響應曲面試驗設計及結果

由單因素試驗可知，木糖醇添加量對枸杞發酵飲料的感官評分影響較小，因此選取其中4個因素，即體積比、接種量、發酵時間、發酵溫度為自變量，以感官評價得分為因變量，設計響應面優化試驗，響應面試驗設計方案及結果如表3所示。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Response surface test design and results

續表3 響應面試驗設計及結果Continue table 3 Response surface test design and results

2.2.2 枸杞發酵飲料感官評價模型的建立與分析

通過Design-Expert.V8.0.6對表3的數據進行處理，得到枸杞發酵飲料感官評分與4個因素的多元二次回歸方程：Y=93.38+3.83A-0.46B+2.91C-0.47D-3.83AB+4.44AC-3.55AD-4.17BC-10.02A2-8.34B2-7.77C2-10.56D2。模型回歸系數顯著性檢驗結果如表4所示[22]。

表4 模型回歸系數顯著性檢驗結果Table 4 Model regression coefficient significance test results

續表4 模型回歸系數顯著性檢驗結果Continue table 4 Model regression coefficient significance test results

由表4可知，模型P＜0.000 1，極顯著，失擬項P＞0.05，不顯著，相關系數R2=0.933 8，表明該模型擬合程度較好，能夠對枸杞發酵飲料工藝進行預測[23]。CV=0.675 6%，說明模型較可靠。RSN=14.624＞4，R2Adj=0.884 2，說明模型置信度較高[24]。4個因素對感官評分影響的順序為A＞C＞D＞B，體積比對感官評分的影響最顯著。交互作用AB、AC、AD、BC對感官評分影響顯著；一次項 A、C 和二次項 A2、B2、C2、D2對感官評分的影響極顯著。

2.2.3 交互作用分析

通過Design-Expert.V8.0.6軟件對得出的試驗數據進行分析，建立了該工藝條件的模型。在保證體積比、接種量、發酵時間與發酵溫度4個因素中一個因素不變的情況下，得到其他因素的三維響應面曲線和等高線。不同因素之間的交互作用的響應面曲線與等高線具體如圖7～圖10所示。

響應曲面越陡，等高線越密集，表明因素之間的交互作用越明顯[25]。從響應面曲線可以看出，交互作用為AC＞BC＞AB＞AD。說明體積比和枸杞發酵時間的交互作用對枸杞發酵飲料的感官品質影響最為顯著。而體積比與枸杞發酵溫度的交互作用對枸杞發酵飲料的感官品質影響相對較弱

通過響應面分析得到最優的工藝條件為體積比10.37∶1、接種量 1.89%、發酵時間 6.16 h、發酵溫度32.95℃，此發酵條件得到的感官評分預測值為94。根據實際發酵條件，以體積比10.5∶1、接種量2%、發酵時間6 h、發酵溫度33℃的工藝條件進行驗證，在此條件下進行獨立3次試驗，得到的枸杞發酵飲料感官評分實際值為93.8±0.32。與模型預測值接近，證明此模型可靠。由此工藝得到的枸杞發酵飲料兼具枸杞的清香以及特殊的發酵風味，酸甜適中，為生產應用提供了理論參數。

圖8 體積比和發酵時間對感官評分影響的響應面與等高線圖Fig.8 Response surface and contour map of the influence of volume ratio and fermentation time on sensory score

圖9 體積比和發酵溫度對感官評分影響的響應面與等高線圖Fig.9 Response surface and contour map of the influence of volume ratio and fermentation temperature on sensory score

圖10 接種量和發酵時間對感官評分影響的響應面與等高線圖Fig.10 Response surface and contour plots of inoculum size and fermentation time on sensory scores

2.3 枸杞中揮發性成分分析

香氣成分是檢驗枸杞發酵飲料風味的主要指標。本試驗采用頂空固相微萃取結合氣相色譜質譜聯用的方法分析枸杞汁發酵前后風味物質種類及含量的變化。圖11～圖12分別為枸杞汁發酵前后香氣成分的總離子流色譜圖。鑒定結果見表5。

圖11 枸杞發酵前香氣成分的總離子流色譜圖Fig.11 The total ion chromatogram pre-fermentation aroma components wolfberry

圖12 枸杞發酵飲料香氣成分的總離子流色譜圖Fig.12 The total ion chromatogram fermented beverage aroma components wolfberry

由表5結果可知，未發酵枸杞原漿中主要檢測出13種風味物質，其中包括2種醇類物質，1種酯類物質，2種酸類物質，6種酮類物質，2種醛類物質。枸杞發酵液中主要檢測出22種風味物質，其中包括5種醇類物質，2種酯類物質，4種酸類物質，8種酮類物質，3種醛類物質。枸杞發酵后，風味物質的種類和含量得到了增加，其中乙醇的相對含量最高，達到了23.59%，賦予了飲料輕快的香味[26]。酸類物質種類的豐富賦予飲料酸甜的口味。酮類物質中，3-羥基-2-丁酮[27]與2-壬酮[28]具有果香、甜香、清香、椰子及其奶油的香氣[29]，紫羅蘭酮與香葉基丙酮具有甜花香的氣味[30]。這些成分對于枸杞發酵飲料的風味都起到了重要作用。

表5 枸杞發酵前后揮發性風味物質成分及相對含量Table 5 Volatile flavor components and relative content before and after fermentation

3 結論

本研究首先通過單因素試驗對枸杞汁發酵體積比、發酵時間、發酵溫度、木糖醇添加量及接種量5個因素對枸杞發酵飲料的感官品質進行研究。之后，在單因素試驗的基礎上選取較優的因素條件，利用響應面法對體積比、發酵時間、發酵溫度及接種量這4個因素進行Box-Behnken設計，建立植物乳桿菌發酵枸杞汁飲料的二次多項式回歸方程。運用該模型進行最優工藝條件預測，得到的最優發酵工藝條件為體積比10.5∶1、接種量2%、發酵時間6 h、發酵溫度33℃，木糖醇添加量7%，通過試驗驗證，在此發酵條件下的感官評分為93.8。通過頂空固相微萃取結合氣相色譜質譜聯用的方法對枸杞汁發酵前后風味物質種類及含量的變化進行了分析，通過發酵主要得出22種揮發性風味物質，產生了多種香氣成分。根據相關文獻報道[28]，醇類物質中C1～C3醇有輕快的香氣，枸杞汁經過植物乳桿菌CGMCC8198發酵后，產生的乙醇賦予了枸杞飲料爽口清香的氣味。酮類物質含量與種類的增加，尤其是3-羥基-2-丁酮及2-吡啶酮含量的增加賦予枸杞飲料奶香的香氣，2-壬酮的出現對增強爽口清香的氣味起到一定的作用[28]。這些結果表明：經過植物乳桿菌CGMCC8198發酵后，枸杞汁增加或形成一些新的風味物質，它們共同構成枸杞飲料的獨特風味。本研究為枸杞發酵飲料的工業化生產提供了最佳參數，但其營養價值及生理功能有待進一步探究。