響應(yīng)面法優(yōu)化魔芋葡甘露聚糖制備工藝及其理化性質(zhì)分析

王瑤，寧杰，宋慶賀，張憲黨，丁文宇，王志斌，丁麗娜

（山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬內(nèi)分泌與代謝病醫(yī)院（山東省內(nèi)分泌與代謝病研究所），山東濟(jì)南250062）

魔芋（Amorphophallus konjac）為天南星科魔芋屬的多年生草本植物。魔芋在我國(guó)分布廣泛，從陜西、甘肅、寧夏至江南各省區(qū)都有分布，其主要生于疏林下、林椽或溪谷兩旁濕潤(rùn)地區(qū)。我國(guó)不同地區(qū)對(duì)其俗稱(chēng)不同，如江西稱(chēng)其為灰草，云南稱(chēng)其為花麻蛇，陜西稱(chēng)其為花桿蓮、麻芋子等[1]。我國(guó)是最早栽培和食用魔芋的國(guó)家，早在宋代《開(kāi)寶本草》就有魔芋的記載?，F(xiàn)代研究表明，魔芋具降血脂、降血糖、減肥[2]、排毒通便[3]、免疫調(diào)節(jié)[4]等作用。

眾所周知，膳食纖維與糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水、礦物質(zhì)和維生素并稱(chēng)為第七大營(yíng)養(yǎng)元素，而魔芋正是膳食纖維含量較高的植物之一。研究發(fā)現(xiàn)魔芋膳食纖維是目前發(fā)現(xiàn)的最優(yōu)良的可溶性膳食纖維，其主要成分是葡甘露聚糖（konjac glucomannan，KGM），并且具有重要經(jīng)濟(jì)和保健價(jià)值[5]。KGM是由D-葡萄糖和D-甘露糖以β-1，4糖苷鍵鏈接的雜多糖，它具有強(qiáng)吸水性、高黏性、高膨脹性，以及良好的穩(wěn)定性、增稠性、凝膠性等工藝特性，在食品工業(yè)、醫(yī)藥化工、紡織等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[6]。因此，開(kāi)發(fā)出一種高品質(zhì)、低成本且適合于工業(yè)生產(chǎn)的魔芋葡甘露聚糖制備工藝具有重要意義。

關(guān)于魔芋葡甘露聚糖的提取研究早在1922年就有報(bào)道，目前高純度魔芋葡甘露聚糖的制備方法主要有乙醇洗脫法、生物酶法、酸水解法、超聲輔助提取法等[7]。這些方法各式各樣，也都取得了較好的效果，然而仍存在引入有機(jī)及化學(xué)試劑、難以工業(yè)化生產(chǎn)等問(wèn)題，尤其是對(duì)KGM分子結(jié)構(gòu)的破壞影響少有報(bào)道[8]。因此，本研究以新鮮魔芋為原料，采用響應(yīng)面法對(duì)高純度KGM制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，并研究分析其持水力、膨脹力、持油力、陽(yáng)離子交換能力功能性質(zhì)，通過(guò)電子顯微鏡掃描、紅外光譜分析和X-射線衍射分析測(cè)定其結(jié)構(gòu)，為魔芋KGM的進(jìn)一步合理開(kāi)發(fā)與利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魔芋品種為白魔芋，采自重慶市；淀粉酶（40 000 U/g）：索萊寶生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、碘化鉀、硫酸銅、鹽酸、石油醚等（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動(dòng)凱氏定氮儀（2300型）、樣品消化爐（2006型）：瑞典FOSS.TECATOR公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-2550型）：日本島津公司；高速離心機(jī)（3K30）：sigma公司；電子天平（SQP）：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet710）：美國(guó)尼高公司；熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SUPRATM55）：德國(guó)蔡司公司；銳影X射線衍射儀（EMPYREAN）：荷蘭PANalytical公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 魔芋基本成分檢測(cè)

取新鮮魔芋塊莖，洗凈、去皮，切片后參考食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)魔芋中各基本成分進(jìn)行檢測(cè)：水分測(cè)定采用直接干燥法[9]；灰分檢測(cè)通過(guò)灼燒后測(cè)定總灰分[10]；淀粉檢測(cè)采用酸水解法[11]；蛋白質(zhì)檢測(cè)采用凱氏定氮法[12]；脂肪檢測(cè)采用索式提取法[13]；膳食纖維采用酶-重量法[14]。

1.3.2 魔芋中葡甘露聚糖的提取流程

鮮魔芋→去皮、切片→50%乙醇打漿（重復(fù)3次）→離心（3000r/min，離心1min，棄上清液）→KGM粗品→70%酸性乙醇（pH 5.5）洗脫46 min→風(fēng)干→KGM。

1.3.3 魔芋葡甘露聚糖含量及得率的測(cè)定

KGM含量測(cè)定方法參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18104-2000《魔芋精粉》中方法，KGM得率計(jì)算公式如下：

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)預(yù)試驗(yàn)，選取洗脫時(shí)間、洗脫液pH值、乙醇濃度3個(gè)對(duì)KGM得率的影響比較明顯的因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，采用乙醇梯度洗脫法制備KGM，測(cè)定其含量并計(jì)算出得率，以確定響應(yīng)面試驗(yàn)的水平范圍。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇洗脫時(shí)間、pH值、乙醇濃度3個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)水平因素編碼表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Response surface test factor level table

1.3.6 魔芋葡甘露聚糖的理化性質(zhì)研究

1.3.6.1 KGM黏度的測(cè)定

參照GB/T 18104-2000《魔芋精粉》中方法，使用黏度計(jì)進(jìn)行測(cè)定[15]。

1.3.6.2 KGM持水力性質(zhì)分析

參照鄧林等[16]方法，稍加改進(jìn)。稱(chēng)取質(zhì)量為m0的KGM加入到質(zhì)量為m1的離心管中。加入10 mL蒸餾水后，將樣品與其混勻。常溫下密閉保存12 h，以5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min，用滴管吸取上層水分，稱(chēng)量吸取水分后的離心管質(zhì)量m2。每一樣品平行測(cè)定3次，按公式（2）計(jì)算持水力：

1.3.6.3 持油力的測(cè)定

參考Yaich等[17]的方法并稍加修改，稱(chēng)取質(zhì)量為m0的KGM加入到質(zhì)量為m1的離心管中。加入食用油4.000 g，將樣品與其混勻后于37℃水浴鍋中密閉保存4 h，然后將離心管以5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min，用滴管吸取上層油液，稱(chēng)量吸取水分后的離心管質(zhì)量m2。每一樣品平行測(cè)定3次，按公式（3）計(jì)算持油力：

1.3.6.4 膨脹力的測(cè)定

參照Benítez等[18]方法，稍加改動(dòng)。稱(chēng)取質(zhì)量為m的KGM置于10 mL帶刻度的試管中并記錄其體積V1。加入7 mL蒸餾水，混勻后置于4℃靜置17 h，記錄樣品吸水后的體積數(shù)V2。膨脹力按公式（4）計(jì)算：

1.3.6.5 陽(yáng)離子交換能力的測(cè)定

參照Chau等方法[19]，將稱(chēng)取的質(zhì)量為m的KGM加入干燥的50 mL離心管中，加入20 mL鹽酸溶液（0.1 mol/L），密封后于25℃下靜置12 h，以5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min，棄去上清液后用蒸餾水洗滌濾渣至濾液中不含氯離子。將濾渣轉(zhuǎn)移至干燥的150 mL錐形瓶中，加入100 mL氯化鈉溶液（5%），用磁力攪拌器攪拌30 min后，以酚酞為指示劑，氫氧化鈉溶液（0.1 mol/L）為滴定劑進(jìn)行滴定，滴定至溶液變色且3 min不褪色為止，同時(shí)做空白試驗(yàn)。滴定樣品消耗的氫氧化鈉溶液體積為V1，滴定空白樣所消耗氫氧化鈉溶液體積為V0。陽(yáng)離子交換能力按公式（5）計(jì)算：

1.3.7 掃描電子顯微鏡分析（scanning electron microscope，SEM）

將待測(cè)樣品干燥后，取適量顆粒黏附在樣品臺(tái)上，在真空條件下鍍金，之后用掃描電子顯微鏡在5 kV下掃描觀察KGM表觀形貌，并放大50、250、1 000、5 000倍對(duì)微觀結(jié)構(gòu)觀察拍照[20]。

1.3.8 傅里葉紅外光譜分析（Fourier transform-infrared spectrometer，F(xiàn)T-IR）

按照1∶50的質(zhì)量比準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥的KGM樣品與溴化鉀粉末，在瑪瑙研缽中充分混勻、研磨。用液壓機(jī)壓成透明薄片后在波長(zhǎng)范圍為4 000 cm-1～400 cm-1進(jìn)行紅外光譜掃描。掃描在25℃干燥條件下進(jìn)行，同時(shí)在樣品測(cè)定前掃描空氣背景，并將結(jié)果扣除空氣干擾[21]。

1.3.9 X-射線衍射分析（X-ray diffraction，XRD）

將KGM樣品通過(guò)荷蘭PANalytical公司的銳影X射線衍射儀進(jìn)行檢測(cè)，參照文獻(xiàn)檢測(cè)條件，并稍加修改為：靶型Cu，管壓40 kV，管流 40 mA，掃描區(qū)域2θ角度為 5°～45°[22]。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)試驗(yàn)最少重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用軟件ORIGIN2019b進(jìn)行圖表制作，Design Expert 10進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 魔芋基本成分分析

新鮮魔芋基本成分的含量見(jiàn)表2。

表2 新鮮魔芋基本成分的含量Table 2 Contents of basic ingredients of fresh konjac %

由表2中檢測(cè)結(jié)果可知，新鮮魔芋塊莖中除去水分之外的主要成分為膳食纖維（12.05%）和淀粉（4.62%），脂肪含量較低。因此，魔芋富含膳食纖維，尤其是優(yōu)質(zhì)的水溶性膳食纖維，是制備膳食纖維的良好材料，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[23]。

2.2 魔芋葡甘露聚糖制備單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇洗脫濃度對(duì)KGM得率的影響

分別稱(chēng)取10 g KGM粗品于5個(gè)200 mL燒杯中，分別加入濃度40%、50%、60%、70%、80%pH5.5的酸性乙醇80mL，置于40℃水浴中磁力攪拌洗脫45min，抽濾，晾干后測(cè)KGM含量并計(jì)算得率。乙醇洗脫濃度對(duì)KGM得率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇洗脫濃度對(duì)KGM得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of KGM

由圖1結(jié)果可知，在一定的乙醇濃度范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的升高，KGM提取率逐漸升高，在70%乙醇濃度后繼續(xù)提高乙醇濃度出現(xiàn)下降趨勢(shì)。其原因可能為在乙醇濃度低時(shí)，部分KGM解于水中流失，而濃度高的乙醇抑制KGM結(jié)構(gòu)展開(kāi)不利于雜質(zhì)的洗脫，因此選擇洗脫乙醇濃度為70%。

2.2.2 洗脫時(shí)間對(duì)KGM得率的影響

分別稱(chēng)取10 g KGM粗品于4個(gè)200 mL燒杯中，加入濃度70%pH5.5的酸性乙醇80 mL，分別置于40 ℃水浴中磁力攪拌洗脫 15、30、45、60 min，抽濾，晾干后測(cè)KGM含量并計(jì)算得率。洗脫時(shí)間對(duì)KGM得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 洗脫時(shí)間對(duì)KGM得率的影響Fig.2 Effect of time on the extraction rate of KGM

由圖2結(jié)果可知，在一定的洗脫時(shí)間內(nèi)，隨著洗脫時(shí)間的延長(zhǎng)，KGM提取率逐漸升高，在45 min后繼續(xù)延長(zhǎng)洗脫時(shí)間得率出現(xiàn)下降趨勢(shì)。洗脫時(shí)間過(guò)短，不利于雜質(zhì)的洗出；洗脫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)引起部分KGM降解，因此，選取洗脫時(shí)間為45 min。

2.2.3 洗脫液pH值對(duì)KGM得率的影響

分別稱(chēng)取10 g KGM粗品于4個(gè)200 mL燒杯中，分別加入濃度 70%pH 3.5、4.5、5.5、6.5 的酸性乙醇 80 mL，置于40℃水浴中磁力攪拌洗脫45 min，抽濾，晾干后測(cè)KGM含量并計(jì)算得率。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 洗脫液pH值對(duì)KGM得率的影響Fig.5 Effect of eluent pH value on the extraction rate of KGM

由圖3結(jié)果可知，在一定的pH值范圍內(nèi)，隨著pH值的增大，KGM提取率逐漸升高，在pH 5.5后繼續(xù)增加pH值得率出現(xiàn)下降趨勢(shì)。pH值過(guò)大或過(guò)小都不利于KGM的提取，表明pH值對(duì)KGM得率影響顯著，因此選擇pH 5.5的酸性乙醇為洗脫液，與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的在弱酸性條件下可以提高KGM的洗脫純度結(jié)論相一致[24]。

2.3 魔芋葡甘露聚糖制備響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

KGM響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 KGM制備響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Box-Behnken experimental design arrangement and experimental results of KGM

由表3結(jié)果可知，利用Design Expert 10.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出KGM得率對(duì)pH值、提取溫度和提取時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸方程為：

R=-27.832 5+0.576 93A+14.618 25B+0.118 88C-0.001 25AB-0.000 45AC-0.006 33BC-0.003 87A2-1.254 5B2-0.000 55C2

2.3.2 方差分析結(jié)果

KGM制備試驗(yàn)方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

由表4方差分析結(jié)果可知，響應(yīng)面模型的F=169.70、P＜0.0001（極顯著）、失擬項(xiàng) P=0.5017＞0.05（不顯著），這表明該模型具有較高的顯著水平，此試驗(yàn)方法具有較高可靠性，且其它非試驗(yàn)因素對(duì)KGM得率影響不大；模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.995 4，校正相關(guān)系數(shù)R2adj=0.989 3，這表明此模型能較好地模擬各因素與KGM得率的關(guān)系且準(zhǔn)確性較高；其中試驗(yàn)因素B、A2、B2達(dá)到極顯著水平。總之，該模型方程可以很好的分析和預(yù)測(cè)不同條件下提取KGM得率的變化情況。

2.3.3 KGM制備各試驗(yàn)因素間相互作用的響應(yīng)面和等高線結(jié)果

KGM制備各試驗(yàn)因素間相互作用的響應(yīng)面和等高線結(jié)果見(jiàn)圖4。

綜合分析Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果可知，乙醇濃度、洗脫液pH值、洗脫時(shí)間對(duì)KGM得率的影響從大到小為：pH值＞乙醇濃度＞時(shí)間，其中pH值影響極顯著（P＜0.01），乙醇濃度影響顯著（P＜0.05）。交互項(xiàng)的影響從大到小排列依次為：pH值和時(shí)間＞濃度和pH值＞濃度和時(shí)間，其中pH值和時(shí)間交互作用顯著（P＜0.05），其余不顯著（P＞0.05）。

圖4 各試驗(yàn)因素間相互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots of interaction among test factors

2.3.4 KGM制備工藝條件的確定和驗(yàn)證

根據(jù)Design Expert 10.0軟件預(yù)測(cè)結(jié)果可知，當(dāng)制備工藝為用70.9%的乙醇，在pH值為5.67的條件下，洗脫46.2 min時(shí)KGM得率最高，可達(dá)36.85%?？紤]實(shí)際生產(chǎn)情況，最終將優(yōu)化條件修正為：乙醇濃度70%，pH值為5.5和洗脫時(shí)間46 min，在此條件下重復(fù)3次平行試驗(yàn)，KGM得率分別36.39%、36.54%和36.81%，平均值為（36.58±0.21）%，與預(yù)測(cè)值較為接近，表明該模型優(yōu)化得到的KGM制備條件準(zhǔn)確性及實(shí)際操作性較好。

2.4 魔芋葡甘露聚糖功能性質(zhì)測(cè)定

KGM黏度、持水力、膨脹力、持油力、陽(yáng)離子交換能力的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，提取得到的葡甘露聚糖具有高黏性、強(qiáng)吸水性及高膨脹性，分別達(dá)到29500mPa·s、49.81g/g、18.77 mL/g；這與其排毒通便、降脂減肥功能密切相關(guān)。同時(shí)各功能性質(zhì)指標(biāo)與文獻(xiàn)[15，24]報(bào)道相符，說(shuō)明提取得到的葡甘露聚糖功能性質(zhì)變化不大。

表5 葡甘露聚糖的功能性質(zhì)（±s，n=3）Table 5 Functional properties of KGM（±s，n=3）

表5 葡甘露聚糖的功能性質(zhì)（±s，n=3）Table 5 Functional properties of KGM（±s，n=3）

樣品黏度/（mPa·s）持水力/（g/g）膨脹力/（mL/g）持油力/（g/g）陽(yáng)離子交換能力/（mmol/g）葡甘露聚糖 29 500±800 49.81±1.04 18.77±0.18 1.430±0.02 0.254 0±0.01

2.5 魔芋葡甘露聚糖表觀形貌

圖5分別為KGM在50倍、250倍、1 000倍及5 000倍的掃描電鏡圖。

通過(guò)觀察圖5可以得知，KGM呈不規(guī)則球形，大小分布不均勻，將其中一個(gè)顆粒放大顯微倍數(shù)觀察，可以發(fā)現(xiàn)顆粒表面相對(duì)光滑，同時(shí)吸附有雜質(zhì)，這與相關(guān)文獻(xiàn)[25]報(bào)道一致。

2.6 魔芋葡甘露聚糖傅里葉紅外光譜分析

KGM紅外光譜圖見(jiàn)圖6。

圖5 魔芋葡甘露聚糖掃描電鏡圖Fig.5 SEM photographs of KGM

圖6 魔芋葡甘露聚糖紅外光譜圖Fig.6 IR spectrum of KGM

觀察圖6發(fā)現(xiàn)，其結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[26]。在3386、2 926 cm-1和1 400 cm-1～12 00 cm-1等處的吸收峰均為多糖的特征吸收峰。在3 600 cm-1～3 200 cm-1處出現(xiàn)一較強(qiáng)寬單峰，此為羥基伸縮振動(dòng)引起，說(shuō)明KGM可能存在著較多的羥基及結(jié)合水分子[27-28]。在2 929.51cm-1處為C-H的伸縮振動(dòng)；2 148.00 cm-1為叁鍵或累積雙鍵特征吸收峰；1 645.12 cm-1處為分子內(nèi)氫鍵特征吸收峰；在1 384.59 cm-1處為C-H的伸縮振動(dòng)。在1 350 cm-1～1 200cm-1范圍內(nèi)的吸收峰為C-H的變角振動(dòng)，是糖類(lèi)的特征吸收峰[29]。1 154.45 cm-1處為C-O酯鍵特征吸收峰；在1 079.61 cm-1和1 023.79 cm-1處同樣為多糖類(lèi)的特征吸收峰，由C-O醇鍵伸縮振動(dòng)引起；781.87、612.20、520.19 cm-1處為吡喃型糖環(huán)特征吸收峰[30]。

2.7 魔芋葡甘露聚糖的X-射線衍射掃描結(jié)果

圖7為KGM的X-射線衍射圖。

圖7 魔芋葡甘露聚糖的X-射線衍射圖Fig.7 X-ray diffraction pattern of KGM

由圖7結(jié)果可知，樣品衍射圖譜總體呈現(xiàn)彌散狀，說(shuō)明樣品以非晶態(tài)為主，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[31]。另在2θ角 14.8、24.2、26.4、29.9 °處有較弱衍射峰，說(shuō)明樣品中含有少量晶態(tài)成分，提取后的KGM含有大量的無(wú)定型區(qū)域，少量的結(jié)晶成分隱藏在其中。

3 結(jié)論

本文對(duì)魔芋葡甘露聚糖的制備、性質(zhì)及結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)性的研究。首先，應(yīng)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法得到魔芋葡甘露聚糖提取工藝：將鮮魔芋用3倍量50%乙醇打漿后，離心、干燥，再用8倍量70%酸性乙醇（pH=5.5）洗脫46 min，真空干燥后得葡甘露聚糖。其次，對(duì)制備的魔芋葡甘露糖理化性質(zhì)進(jìn)行分析，其持水力為49.81 g/g、膨脹力 18.77 mL/g、持油力為 1.43 g/g、陽(yáng)離子交換能力為0.254 mmol/g。掃面電鏡圖結(jié)果顯示魔芋葡甘露聚糖為表面帶有溝壑的顆粒狀，紅外光譜顯示其具有多糖特征吸收峰，X-射線衍射顯示其晶型結(jié)構(gòu)以非晶態(tài)為主，并有少量結(jié)晶成分隱藏其中。其理化性質(zhì)與文獻(xiàn)報(bào)道相一致，這表明本提取工藝對(duì)魔芋葡甘露聚糖的結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)影響較小。