一株靈芝病原真菌的分離鑒定及生長環境初探

張鳳凱 付強 公旭謙 崔波 唐玉琴 徐濟責

摘 要：為明確靈芝病原真菌的歸屬，采用組織分離法[1]獲得病原菌株，結合形態學及分子生物學方法對分離菌株進行鑒定，從顯微特征和分子生物學對其進行分析鑒定;測定不同溫度、pH、光照等條件下對病原菌產孢量、尖端菌絲數量的影響。結果表明：形態學鑒定及分子生物學鑒定為側耳木霉，通過SPSS數據分析不同溫度，pH對病原菌的產孢量與菌絲尖端數量有明顯差異，光照則無明顯差異。溫度在15℃時產孢量為零，溫度在15℃與30℃時尖端菌絲數量最少;pH為5與9時產孢量、尖端菌絲數量最少，因此靈芝病原菌為側耳木霉，溫度在15℃與30℃，pH為5與9時對產孢量和尖端菌絲數量影響最大。

關鍵詞：靈芝;側耳木霉;鑒定;rDNA-ITS序列

Abstract：In? order? to? identify? the? ascription? of? Ganoderma? lucidum? pathogenic? fungi，the? pathogen? strains? were? obtained? by? tissue? isolation method[1].The? isolated? strains? were? identified? by? morphological? and? molecular? biological? methods.The? effects? of? different? temperature，pH? and light? on? the? sporulation? and? the? number? of? hyphae? were? determined.The? results? showed? that? Trichoderma? orientalis? was? identified? as Trichoderma? orientalis? by? morphology? and? molecular? biology.SPSS? data? were? used? to? analyze? the? difference? of? sporulation? and? hyphae? tip number? between? different? temperature? and? pH? value，but? there? was? no? significant? difference? in? light? intensity.At? 15℃，the? spore? production was? zero，and? the? temperature? was? 15℃? and? 30℃，respectively.When? the? temperature? was? 15℃? and? 30℃，pH? was? 5? and? 9，and? the? number? of apical? hyphae? was? the? least.Therefore，the? pathogen? of? Ganoderma? lucidum? was? Trichoderma? Pleurotus，the? temperature? of? 15℃? and? 30℃，pH 5? and? 9? had? the? greatest? influence? on? the? sporulation? and? the? number? of? apical? hyphae.

Key? words：Ganoderma? lucidum;Trichoderma? pleuroticola;identification;rDNA-ITSsequence

靈芝（Ganoderma lucidum）屬擔子菌門，層菌綱，非褶菌目，靈芝科[2]。靈芝中含有大量的多糖，甾醇和三萜類物質，具有扶正固本、增強免疫力功能、提高機體抵抗力的作用[3-6]。曹妮娜等調查藍山縣靈芝栽培中發現青霉病、木霉病、褐腐病與靈芝白僵病四種病害居多[7];解宜林在安徽靈芝病害調查中發現霉菌危害靈芝最為嚴重，尤其是木霉菌[8];汪義平在安徽省旌德縣靈芝病害的調查中發現木霉發病快，危害嚴重，除此之外，褐腐病、鏈孢霉、曲霉與黏菌也作為靈芝病害[9]。2015年我國人工代料和段木栽培面積達到15萬畝左右，靈芝及孢子粉產量約12萬噸，分別約占全球的75%和30%，已成為世界上靈芝的主要生產和出口國[10]。但由于多年使用同一地域栽培，致使嚴重影響靈芝產量和質量的真菌病害頻發，并且已嚴重制約了靈芝產業的發展。為確定靈芝病害種類進行了形態學及分子生物學鑒定。由于外界環境對致病菌生長影響較大，因此試驗測定了不同溫度、pH、光照對其生長所產生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：采集于吉林省蛟河市靈芝種植基地，從靈芝椴中分離獲得。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL。試劑：真菌DNA提取試劑盒。儀器：PCR擴增儀、電泳儀、凝膠成像儀等。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離

采用組織分離法對病原菌進行分離純化。經多次分離純化，獲得5種病原菌編號分別為：0083、0089、0094、0100、0106。經梯度稀釋獲取單孢病原菌。

1.2.2 致病性測定

將五種單孢病原菌遵循科赫法則[11]進行回接試驗。

1.3 形態鑒定

將0094菌接種于PDA培養基;25℃黑暗培養;每隔24h觀察并記錄菌落的顏色、形狀、氣生菌絲的疏密程度;72h后鏡檢分生孢子的形態、大小、著生方式以及分生孢子梗形態等分類特征鑒定菌株的分類地位[12]。

1.4 病原菌分子生物學鑒定

1.4.1 總DNA的提取

參照鐘志敏等DNA提取方法[13]。

1.4.2 rDNA-ITS序列的擴增和測定

采用真菌核糖體基因轉錄間隔區通用引物ITS1? （5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）、ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）擴增致病菌的ITS和5.8S? rDNA區段。PCR的反應體系為10×PCR? buffer? 5μL，dNTP? 1μL，ITS1? 1μL，ITS4? 1μL，Taq? DNA聚合酶0.5μL，模板DNA 10μL，加ddH2O補足50μL。擴增反應程序為：94℃預變性3min;94℃變性30s;52℃退火30s;72℃延伸1min，30個循環;72℃延伸10min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像儀檢測，將PCR產物送至北京華大基因公司完成測序。

1.4.3 rDNA-ITS序列同源性比較

將0094菌株rDNA-ITS序列在NCBI中BLAST比對，下載相關參照菌株序列。采用MEGA6.0進行同源性分析，獲得菌株聚類分析結果。

1.5 溫度對菌絲生長、產孢時間及產孢量的影響

以PDA培養基為基礎培養基，接種直徑為5mm的0094菌餅，分別置于15℃、20℃、25℃、30℃恒溫、黑暗培養，每個處理5次重復。每隔24h測量菌落直徑，72h后測定產孢量。

1.6 pH對菌絲生長、產孢時間及產孢量的影響

培養基用0.1mol/L? NaOH和0.1mol/L? HCl調節培養基，使pH為5、6、7、8、9。將直徑為5mm的0094菌餅接種于不同酸堿度的PDA培養基上，25℃恒溫、黑暗培養，每個處理5次重復。每隔24h測量菌落直徑，72h后測定產孢量。

1.7 光照對菌絲生長、產孢時間及產孢量的影響

將直徑為5mm的0094菌餅移至PDA培養基上，分別設置連續光照、連續黑暗、交替光照3個處理，25℃恒溫培養，每個處理5次重復。每隔24h測量菌落直徑，72h后測定產孢量。

2 結果與分析

2.1 致病性

通過回接試驗，同靈芝病害比對，確定0094為病原菌。

2.2 菌株的形態學鑒定

病原菌在PDA上產生簇狀白色氣生菌絲，菌絲同心輪紋，開始為綠灰色，很快轉變為灰綠色，后期為暗綠色至黑綠色。菌落背面開始基本無色，隨著菌落增長，在PDA上呈現黑褐色。分生孢子梗分枝近似金字塔形，越接近基部分枝越長，分枝單生或者向梗的主軸基部對生，分生孢子梗及其分枝相對狹窄并且呈波曲狀。主軸基部寬度為5.5μm，最頂端的分枝圓柱形，大小為6～14×2.5～3.3μm。瓶頸對生，安瓿形，頂部突然變細為瓶頸，著生分生孢子，大小為4.2～9.5×3.0～4.2μm，頂生瓶梗細長，長度可達20μm。分生孢子亞球形至寬橢圓形，大小為2.7～5.0×2.5～3.7μm，顯微鏡下觀察為亮綠色，聚集成團時為黑灰色，壁光滑。厚垣孢子通常呈串或者呈簇，亞球形，直徑4～10μm，蒼綠色。

2.3 分子生物學鑒定

由圖1可知0094的16SrDNA序列與Trichoderma pleuroticola序列的同源性最高，結合形態學鑒定，確定0094菌株為側耳木霉。

2.3 溫度對側耳木霉菌絲生長、產孢量及尖端菌絲數量的影響

2.4 pH對側耳木霉菌絲生長、產孢量及尖端菌絲數量的影響

2.5 光照對側耳木霉菌絲生長、產孢量及尖端菌絲數量的影響

3 討論

靈芝病害的類型有青霉病、木霉病、褐腐病、鏈孢霉、曲霉與黏菌等，各種病害的發病率都呈有逐年上升、危害加重的趨勢，尤其是霉菌引發的病害。分子生物學鑒定包括rpb2、ITS序列的鑒定，該病原菌ITS序列比對同源性較高，所以優先采用ITS進行同源性分析。外部環境對病原菌生長的影響很大，在椴木栽培靈芝生產中濕度固定，溫度難以控制。側耳木霉主要靠產生孢子傳播，因此產孢量的多少對側耳木霉引發的靈芝病害有影響。其次尖端菌絲數量越多，吸收養分的能力越大，為此試驗測定溫度、pH、光照三個因素對病原菌的生長速度、產孢量及尖端菌絲數量的影響。結果表明光照條件對側耳木霉產孢量和尖端菌絲數量無明顯影響，病原菌最不適的生長條件為溫度在15℃，pH為5或9，但溫度過低，pH過酸或過堿會影響靈芝的生長，找到最適宜的溫度、pH有待進一步研究。

參考文獻

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