番茄抗黃化曲葉病研究進展

馬藝蕎 范惠冬 鄭士金 鄭建超 耿偉

摘 要：番茄黃化曲葉病是番茄生產中毀滅性病害。本文系統的綜述了番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）發生規律、番茄黃化曲葉病毒病（TYLCVD）抗病基因及防治措施三個方面內容。為番茄黃化曲葉病毒病的監控、防治提供科學依據。

關鍵詞：番茄黃化曲葉病;抗病基因;防治措施

番茄黃化曲葉?。═omato? ?yellow? ?leaf? ?curl? ?virus? ?disease，TYLCVD）的發生給全球番茄生產造成了巨大的經濟損失[1]。2011年番茄黃化曲葉病毒（Tomato? ?yellow? ?leaf? ?curl? ?virus，TYLCV）被列入十大重要植物病毒之一[2]。1939-1940年，番茄黃化曲葉病在以色列被首次發現[3]，1995年該病傳入我國[4]，近年來在我國多個番茄主產區大范圍發生，2011年該病在我國新疆喀什地區番茄主產區大面積爆發，發病率最高達100%[5]。2014年有報道稱該病在我國的年發生面積超過20萬畝，年經濟損失超過十億元[6]。

近幾年該病害的發生具有爆發突然、發病迅猛、擴散迅速、危害嚴重、治療困難、損失巨大等特點[7]，因此，番茄黃化曲葉病的綜合防控研究已經刻不容緩。目前針對該病的防治，可通過化學防治、生物防治和物理防治的方法在一定程度上減輕該病的危害，但都存在防治不徹底、易復發等問題，無法從根本上解決這一問題，而選育番茄抗黃化曲葉病品種是較為經濟、有效、綠色、持久的防治方法[2，8]。

1 番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）

1.1. TYLCV基因組組成及結構

番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）屬于雙生病毒科（Genminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus），雙生病毒是一類具有孿生顆粒形態的單鏈環狀DNA（Singlestranded? DNA，ssDNA）。與其它大多數菜豆金色花葉病毒不同，TYLCV是植物病毒中唯一一類具有孿生顆粒形態的單鏈環狀DNA病毒[9，10]。TYLCV的寄主非常廣泛，包括茄科、葫蘆科、豆科、菊科、十字花科、白花菜科等12個科，主要侵染茄科。2009年，Michael等研究表明，很多野草也是TYLCV的寄主，但一般情況下是無癥狀感病。

TYLCV的DNA-A編碼6個開放性閱讀框（Opening? ?reading frames，ORFs），這些ORF被大約200bp的基因間隔區（Intergenic region，IR）分為病毒鏈和互補鏈，病毒鏈編碼V1和V2，互補鏈編碼C1，C2，C3和C4。2007年，Bruno Gronenborn等研究發現IR區最突出的區域是莖-環結構：由2個10-12bp的反向重復序列的莖和1個包含9個核苷酸序列[12，13]。

2 番茄黃化曲葉?。═YLCV）抗病基因

據報道，早期的栽培番茄種質資源中缺乏抗TYLCV的基因，僅有一些表現為耐病的資源，抗TYLCV的基因大多存在于番茄的近緣野生種中[14]。過去的研究表明，在秘魯番茄（Lycopersicon? peruvianum）、醋栗番茄（Lycopersicon? pimpinellifolium）、契斯曼尼番茄（Lycopersicon? cheesmanii）、多毛番茄（Lycopersicon hirsutum）和智利番茄（Lycopersicon? chilense）這幾種野生番茄中篩選出抗TYLCV的基因[15]。通過將栽培種與這些野生番茄進行雜交，可以將抗TYLCV的基因轉入到栽培番茄中，從而使栽培番茄產生抗病性。

目前，已經定位到的抗TYLCV基因有6個，分別為Ty-1，Ty-2，Ty-3，Ty-4，Ty-5和Ty-6，這6個基因在染色體上的位置各不相同，功能上又各具特點（圖1，表2）。

抗TYLCV基因連鎖標記的開發，不僅為抗病基因的克隆奠定基礎，同時也可用于抗病新品種的選育過程，可極大的提高育種效率。將目前與抗TYLCV基因緊密連鎖，且應用較多的分子標記匯總于表3，方便在后續育種工作中得以應用。

3 番茄黃化曲葉病毒?。═YLCVD）的防治措施

自20世紀90年代傳入我國以來，番茄黃化曲葉病毒病蔓延極其迅速，目前已在我國各大番茄產區大面積發生，給我國番茄生產造成了極大的損失。由于雙生病毒科成員分布廣泛且寄主范圍多樣，作為TYLCVD的傳毒途徑，煙粉虱數量的極速增加，因此TYLCVD引起了全球的重點關注，TYLCVD的防控形勢十分嚴峻。目前，番茄黃化曲葉病毒?。═YLCVD）的遵循“預防為止、綜合防治”的防治措施，采取包括加強苗期管理、物理防治、化學防治和生物防治的傳統防治，以及RNA干擾（RNAi）技術、基因編輯、分子標記輔助選擇（MAS）等新一代防治措施。這些措施不只局限于防治TYLCD，也適用于防治其他病毒病。

3.1 常規防治措施

防治任何疾病的首要任務是確定病因，然后再制定防治策略。許多病毒可能產生的癥狀較為類似，且有時多病毒復合侵染，單純的目測法有一定的局限性。目前，可通過酶聯免疫吸附（ELISA）法、聚合酶鏈式反應（PCR）法、核酸雜交法、環介導等溫擴增（LAMP）法、實時熒光定量PCR（Real-time? ?PCR）等方法快速、準確的大量檢測樣本，對TYLCVD綜合防治具有重要意義。

在種植前進行合理的規劃是防治病毒病必不可少的環節。清潔棚內及園區衛生，及時清理棚內殘株及周圍雜草;可選擇煙粉虱不喜食的作物進行輪作套作;抗病品種的種子需要通過正規渠道進行購買;在無病蟲育苗基地進行育苗，加強苗期光、溫、水、氣、肥五個因素合理調控，提高番茄苗的抗病能力;定植期嚴防病株混入。

防控病毒病的關鍵有時不是病毒本身，而是病毒載體。因此，嚴控煙粉虱蟲口數量對預防病毒病爆發十分有效。很多物理防治方式都在生產中已有廣泛應用，如在大棚的通風口鋪設50～60目的防蟲網;利用煙粉虱的趨黃性，每畝地懸掛20～30張黃色粘蟲板;利用煙粉虱的趨光性，在大棚懸掛10～15個/畝的熒光殺蟲燈;利用不同顏色的地膜，對煙粉虱在葉片下的活動有較大影響等[19]。

化學防治仍是控制煙粉虱蟲口數量的最直接有效的方式。阿維菌素、吡蟲啉、啶蟲脒、阿克泰和噻蟲嗪等殺蟲劑對防治煙粉虱效果較好。生產上選用的殺蟲劑種類較多，且煙粉虱會在較短時間內產生抗藥性，因此在今后的生產中應選用高效、低毒、低殘留的化學藥劑顯得尤為重要[6]。

利用生物防治的方式，可以防控煙粉虱的種群數量爆發。例如煙粉虱的捕食性天敵，如瓢蟲類、撲食蝽及捕食螨等;煙粉虱的寄生性天敵如恩蚜小蜂屬的麗蚜小蜂、槳角蚜小蜂屬的槳角蚜小蜂及闊柄跳小蜂屬等。但由于捕食性天敵多為多食性捕食者，寄生性天敵需在煙粉虱蟲口數量較低時發揮作用，且成本較高等因素，因此在實際生產中相對推廣較難[20]。

總之，早期進行病毒檢測，結合合理的綜合防控管理方式，對防控TYLCVD是十分重要的。

3.2 新一代防治措施

轉基因技術是控制病毒感染的有效途徑，但是由于轉基因生物（GMOs）的商業化受限，還未被民眾接受。病原衍生抗性（PDR）策略在抗番茄黃化曲葉病研究上獲得成功。2004年，Antignus.Y和YangY等已用病毒基因片段、TYLCV的CP和Rep基因進行植株轉化，用于實現PDR。RNAi技術，包括發夾結構的病毒基因組序列的表達，已經獲得很好的結果。2006年，Fuentes? A等將TYLCV的Rep基因轉入番茄后，獲得的植株對TYLCV的免疫能力。2007年，Zrachya? A等證實以TYLCV的CP為靶點的siRNA可使轉基因番茄植株產生TYLCV抗性。2010年，唐前君等將TYLCCNV的CP基因構建dsRNA載體轉入煙草中，獲得TYLCV的抗性。2015年，Ammara，U.E.等研究表明，轉化植株表達來自TYLCV-OM的IR、V1和V2區的dsRNA序列，可使約75%的轉基因番茄感染減少。同年，Leibman，D.等也證實了免疫性與含有特異性病毒片段的轉基因siRNAs產物有關。非轉化方式的成本與可行性收到廣泛關注。2019年，Leibman，D.和Cagliari，D.等為了避免公眾對轉基因生物的關注，采用一種在植物上噴灑dsRNA/siRNA的噴霧誘導基因沉默（SIGS）的非轉化方式。合成miRNA介導的病毒基因沉默技術為抗TYLCV提供一種新途徑。

2019年，Carbonell，A.等研究表明在抗番茄斑點萎蔫病毒（TSWV）上，合成反式作用siRNAs（syn-ta-siRNAs）比amiRNA在抗病性方面更有前景。

基因編輯技術是指對特定的DNA位點進行精準“編輯”的一項新技術，通過基因編輯可使靶向位點堿基的插入、缺失、替代等。目前最常見的基因編輯技術包括：鋅指核酸酶（ZFNs）、轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALENs）及CRISPR-Cas9系統。

目前，這些基因編輯技術已成功在番茄、馬鈴薯、葡萄、柑橘、甜瓜等多種果蔬作物中實現了基因組的定向編輯。近年來，CRISPR-Cas9系統應用在改進番茄重要農藝性狀及研究番茄基因功能及其分子機制等方面。CRISPR-Cas9系統在番茄抗性上的具體應用情況詳見表4。

多年來，許多學者發現常規防治措施確實在一定成程度上能局部控制TYLCVD的發生。但從某種意義上講，培育抗病新品種是控制TYLCVD發生的最有效、最具前景的方法。隨著測序技術及高通量基因分型平臺的出現，將分子標記輔助選擇（MAS）技術與傳統的田間選育相結合，可在DNA水平上對育種材料進行篩選，達到加快選育速度、加強選擇準確度、提高育種效率的目的。目前，該技術已廣泛應用在番茄抗TYLCV育種?；蚓酆希╣ene pyramiding）是指將分散在不同品種的目標基因聚合到一個基因組中，通過這種方式，可在較短的育種周期內培育出集高產、優質、多抗于一體的優良種質資源或品種?；蚓酆夏茱@著增強作物抗病、抗蟲能力，從而減少化學農藥的使用，對生態環境有益。目前，我國的育種工作者相繼育成了一系列抗TYLCV及其他病害的優質、多抗番茄新品種品種，如“粵科達301”、“西大櫻粉1號”、“鄭番1203”、“鄭番12158”、“浙粉702”。

4 問題與展望

隨著我國設施園藝的迅猛發展，番茄黃化曲葉病毒病已經成為保護地番茄生產的重要病害。今年來，我們對TYLCV逐步深入了解，但仍很多問題有待解決。在“病毒—傳毒介體—寄主植物”的循環過程中，作為傳毒媒介的煙粉虱，可攜帶多種病毒，而植株可被多種病害復合侵染，在田間控制煙粉虱種群數量是十分必要的。在今后的番茄生產中，早期病毒檢測及針對具體情況制定相應的防控措施，對防治TYLCVD顯得尤為重要。

目前，已有研究表明，將病毒外殼蛋白基因及病毒復制相關蛋白基因轉入植株，可使其獲得抗性[21];另有研究表明，在棉花上表達殺蟲蛋白Tma12具有殺蟲效果，這些方式都具有很好的前景。針對番茄抗TYLCV，選育抗病品種無疑是最好的選擇。

今后的研究主要集中在抗性基因聚合[22]，以及基因沉默和基因編輯等領域。在早期快速檢測的基礎上，以“預防為主，綜合防治”為防控方針，加強抗性資源的開發利用，結合開展分子標記輔助選擇（MAS）進行抗性育種，多舉措推進實現番茄黃化曲葉病毒病的綜合防控，減輕病害造成的經濟損失，提高番茄質量安全，促進設施蔬菜產業的健康發展。

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