子宮腺肌病PGP 9.5、NGF的表達及其與痛經的關系

王文莉 段 華 張 穎 郭銀樹 成九梅

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院婦科微創中心，北京 100026)

子宮腺肌病(adenomyosis，ADS)是最常見的引起繼發性痛經的疾病之一，雖然繼發性痛經發生率很高，但目前對其發病機制的了解仍然有限。本研究旨在探討蛋白基因產物9.5(protein gene product 9.5，PGP 9.5)，神經生長因子(nerve growth factor，NGF)在ADS中的表達情況，研究神經因子在ADS中的表達及其與痛經的關系，探討上述因子在ADS發病及痛經產生中的作用。

1 資料和方法

1.1 研究對象

選取2008年8月～2008年12月間在首都醫科大學附屬北京婦產醫院婦科微創中心接受手術治療的未絕經ADS患者30例，患者年齡28～51歲，平均年齡(45.90±3.97)歲，術前根據視覺模擬評分法［1］(visual analogue scale/score，VAS)對ADS患者的痛經程度進行評分，輕度痛經者12例、中度痛經者9例、重度痛經者9例。在30例患者中取60例病理標本，分為2組:①ADS在位子宮內膜組(ADS－E組)30例標本，其中增生期子宮內膜23例，分泌期子宮內膜7例;②ADS子宮肌層組(ADS－M組)30例標本。對照組為同期因子宮肌瘤、宮頸病變接受手術治療的30例患者，取57例標本，分為2組:①對照在位子宮內膜組(對照－E組)30例標本，增生期子宮內膜23例，分泌期子宮內膜7例?；颊吣挲g26～50歲，平均年齡(41.27±7.05)歲。②對照肌層組(對照－M組)27例標本?；颊吣挲g29～50歲，平均年齡(43.44±5.46)歲。全部病例標本取材經過倫理委員會批準及患者知情同意，病理結果均由2名病理學專家檢查證實，患者未合并有糖尿病、甲狀腺功能亢進、腎上腺功能亢進等神經、內分泌疾病，且術前3個月內未接受激素治療。研究組與對照組患者的年齡，剖宮產史、子宮內膜增生期與分泌期比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

1.2 方法

1)主要試劑:鼠抗人蛋白基因產物9.5(protein gene product 9.5，PGP 9.5)單克隆抗體(1:100)(北京中杉金橋生物技術有限公司產品)、兔抗人神經生長因子(nerve growth factor，NGF)單克隆抗體(1:100)(北京博奧森生物技術有限公司產品)。

2)方法:標本經10%甲醛浸泡，制成石蠟塊。以人小腸和腦組織切片為陽性對照，PBS代替一抗為陰性對照，每例組織石蠟塊切片3張，1張HE染色核實病理診斷，余2張行免疫組化染色。切片厚4μm，石蠟切片常規脫蠟浸水，蒸餾水浸泡5min;PBS沖洗3次;枸櫞酸緩沖液煮沸(沸水浴)修復15 min;PBS沖洗3次;3%過氧化氫水溶液，室溫孕育20 min;PBS沖洗3次;滴加正常山羊血清工作液，37℃孵育15 min，后去除多余正常山羊血清工作液;滴加一抗鼠抗人PGP 9.5單克隆抗體(1:100)、兔抗人NGF單克隆抗體(1:100)4℃過夜。復溫20 min，PBS沖洗3次;二抗孵育，37℃20min，室溫孵育20 min;PBS沖洗3次;三抗(辣根酶標記鏈酶卵白素工作液)孵育，37℃20min;PBS沖洗3次;DAB顯色;自來水充分沖洗，脫水透明、封片。

3)結果判定標準:采用Lecia光學顯微鏡系統，每張切片在Lecia高倍鏡下采用抽簽法隨機觀察4個視野，電腦計算每個視野的陽性細胞數，取平均值［2］。

1.3 統計學方法

所有數據均采用SPSS15.0統計軟件進行分析處理，計量數據采用均數±標準差(±s)表示。各組均數比較先進行方差齊性檢驗，方差齊者采用獨立樣本 t檢驗，方差不齊者進行秩和檢驗，采用Spearman法進行相關性分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 在位子宮內膜功能層中PGP 9.5、NGF的表達

ADS－E組可見 PGP 9.5、NGF的表達，陽性細胞棕黃色顆粒位于細胞質中 (圖1)。對照－E組未見PGP 9.5的表達，僅見NGF的表達(圖2)。對照－E組NGF的表達明顯低于ADS－E組，差異有統計學意義(P ＜0.05)，詳見表1。

表1 在位子宮內膜中PGP 9.5、NGF表達Tab.1 Expression of PGP 9.5 and NGF in endometrium

2.2 子宮肌層中PGP 9.5、NGF的表達

ADS－M組可見 PGP 9.5、NGF的表達，陽性細胞棕黃色顆粒位于細胞質中 (圖3);對照－M組中可見PGP 9.5和NGF的表達(圖4)。對照－M組PGP 9.5、NGF的表達明顯低于ADS－M組，差異有統計學意義(P ＜0.05)，詳見表2。

表2 子宮肌層中PGP 9.5、NGF的表達Tab.2 Expression of PGP 9.5，NGF in myometrium

2.3 PGP 9.5、NGF的表達與痛經的相關性

在ADS－E組中，隨著痛經程度的加重，PGP 9.5、NGF在在位子宮內膜功能層中的表達有顯著的增高趨勢，且PGP 9.5、NGF的表達與痛經程度有顯著相關性(r=0.520和0.688，P ＜0.05)。

在ADS－M組中，隨著痛經程度的加重，PGP 9.5和NGF的表達有顯著的增高趨勢，且與痛經程度有顯著相關性(r=0.543和0.503，P＜0.01)。

3 討論

3.1 子宮腺肌病中神經纖維的分布特點

蛋白基因產物9.5(protein gene product 9.5，PGP 9.5)是一種古老而保守的蛋白質，屬于泛素水解酶系統，廣泛表達于神經元分化的各個階段，是一個神經外胚層細胞來源的神經內分泌系統的特定的組織標志物。本研究組采用PGP 9.5標記神經纖維，發現ADS在位子宮內膜功能層可見PGP 9.5染色的神經纖維，而在對照組正常子宮內膜功能層卻未見神經纖維分布，在子宮內膜基底層可見有PGP 9.5標記的神經纖維存在，在腺肌病灶中也可見有神經纖維存在，且神經纖維多位于腺體和脈管周圍，與其伴行;Tokushige N 等［3－4］研究發現傳導慢痛的 C 類神經纖維在子宮內膜異位癥(endometriosis，EMS)在位子宮內膜見表達，而非EMS患者未見表達。在小鼠的子宮內膜異位癥模型的異位病灶也可見有P物質(substance P，SP)、降鈣基因相關肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)、囊泡單胺類轉運體染色的纖維存在，異位灶中密集的神經纖維分布臨近血管周圍，神經突觸沿著血管分布于子宮肌層及上皮層［5］。不僅如此，PGP 9.5本身作為泛素水解酶系統的重要成員，還參與細胞內凋亡蛋白的代謝，在細胞永生中起重要作用，與各種神經相關性疾病(如帕金森病、阿爾茨海默病等)，惡性腫瘤的復發、預后相關，是獨立的風險因子，在神經再生，腫瘤細胞侵入的調節方面有重要作用［6－7］。因此，ADS患者在位子宮內膜中增生的神經纖維和高度表達的神經生長因子可能為在位的子宮內膜提供了生長及侵襲所需的營養，促進在位子宮內膜發生轉移及侵襲，在異位內膜持續生長、浸潤周圍器官起到了重要作用，但其分子機制有待進一步研究，另外ADS中神經纖維的特異性表達為其診斷提供了新的方向，比如宮腔鏡下內膜活檢甚至刮宮獲取子宮內膜功能層行病理檢查，有助于早期診斷ADS，為后續的治療提供了更大的空間。

3.2 子宮腺肌病中神經纖維及因子與痛經的關系

神經生長因子(nerve growth factor，NGF)是最早發現的靶源性神經營養因子，產生于傳入纖維的外周靶組織和支持細胞，如角質細胞、成纖維細胞和Schwann細胞。它可促進中樞及外周神經元的正常發育與分化，并對受損神經元有促再生和保護作用。NGF可以引導神經細胞觸枝(neurite)的延伸，維持感覺神經元的生存、發育，并選擇性的營養參與疼痛調節的小感覺神經元和交感神經節神經元;同時NGF也是疼痛外周敏感化產生的重要介質之一，它能誘導中樞疼痛的調節因子P物質(SP)，降鈣基因相關肽(CGRP)、神經肽的生成。缺乏NGF和其特殊受體TrKA的轉基因動物出生后表現為缺乏介導傷害性疼痛的神經元和痛覺減退，而NGF過表達的動物則表現為痛覺過敏［7］。

本研究發現，PGP 9.5、NGF在ADS患者子宮內膜的表達與痛經程度成正相關，即PGP 9.5、NGF的表達越高，痛經程度越重。Barcena de Arellano M L等［8］發現子宮內膜異位癥患者痛經與腹水中神經因子表達成正相關，子宮內膜異位癥病灶可釋放一些刺激神經纖維的分子，如腫瘤壞死因子－α(TNF－α)、PGI2、PGE2、PGF2α以及 NGF使異位病灶局部器官的神經纖維向異位病灶內生長［9］;同時，子宮內膜異位癥病灶也可以產生分泌許多疼痛介質，比如PGs、組胺、緩激肽、NGF和白介素等，這些疼痛介質可以刺激末梢神經纖維，產生疼痛［10］，并且神經纖維密度和子宮內膜異位癥相關痛經呈正相關［11］，Zhang G等［12］報道子宮內膜異位癥小鼠模型中卵巢囊腫周圍血管和神經隨著小鼠的動情周期變化，在病灶周圍形成血管及神經，并且在動情前期可以誘發痛覺過敏。腺肌病灶內的神經纖維有可能是由于在位子宮內膜中本身含有神經纖維，移位至其他部位繼續生長而來;也可能由于異位病灶分泌各種神經營養因子，如TNF－a、PGI2、PGE2 和 NGF 等［13］，病灶周圍正常組織的神經纖維受各種神經營養因子的刺激，長入異位病灶所致，并且其促進異位病灶的生長。據此推測，神經因子的增高可導致局部感覺神經纖維敏感性增高產生痛覺，且由于內臟神經沖動的傳入特點，可能發生痛覺過敏的現象［14－15］，病灶局部神經纖維痛覺的傳入就可以表現為痛經。

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