豬腹瀉相關冠狀病毒檢測方法研究進展

李麗 陳弟詩 陳斌 鄧飛 邵靚 丁夢蝶 周莉媛

摘要：豬腹瀉相關的冠狀病毒是可引起豬只嘔吐、腹瀉和脫水等相關癥狀的傳染性疾病，仔豬感染后死亡率可達100%，對養豬業造成了巨大的經濟損失，為此，眾多學者對該病的診斷與檢測方法進行了大量的研究，建立了臨床診斷、病原分離等傳統的診斷方法以及免疫學、分子生物學等新興診斷方法。研究豬腹瀉相關冠狀病毒的診斷與檢測方法對該類疫病的防控具有重要的意義。對豬腹瀉相關冠狀病毒的檢測方法研究進展進行了綜述。

關鍵詞：豬;腹瀉;冠狀病毒;病原學;免疫學;分子生物學;檢測方法

中圖分類號：S858.28? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? 文章編號：1007-273X（2020）07-0011-03

豬腹瀉病是危害養豬業的主要傳染病之一，引起豬只腹瀉的病因很多，包括有營養性腹瀉、病毒性腹瀉、細菌性腹瀉和寄生蟲感染等，其中以病毒性腹瀉的發生率最高、危害最嚴重[1]。常見引起豬只腹瀉的病毒有豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV），豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）和豬Delta冠狀病毒（Porcine deltacorona virus，PDCoV）[2]。這3種病毒均屬冠狀病毒科冠狀病毒亞科。病毒分類委員會將冠狀病毒分為甲型冠狀病毒、乙型冠狀病毒、丙型冠狀病毒和丁型冠狀病毒，其中PEDV和TGEV屬于甲型冠狀病毒，PDCoV屬于丁型冠狀病毒[3]。冠狀病毒是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒顆粒呈球形或橢圓形，大小在60～220 nm，基因組全長25～32 kb，含有多個開放閱讀框（Open reading frame，ORF）。豬冠狀病毒基因組的結構、復制方式和病毒蛋白的表達與人及其他動物的冠狀病毒相似，大多數冠狀病毒包含四種結構蛋白：一個大的表面糖蛋白（Spike或S），一個小的膜蛋白（SM），一個完整的膜糖蛋白（M）以及一個核衣殼蛋白（N）。甲型冠狀病毒其基因組由5非編碼區、0RF1、ORF1b、S、ORF3、E、M、N、3非編碼區組成。丁型冠狀病毒基因組從5-3依次為5非編碼區、ORF1ab、S、E、M、NS6、N、NS7、N和3非編碼區組成[4]。其中S基因保守區域，M基因和N基因常用作檢測的靶基因。PEDV、TGEV和PDCoV都能引起仔豬發生嘔吐和水樣腹瀉，嚴重還會導致厭食、脫水等癥狀，潛伏期短，傳播迅速，多發生在冬季，且以混合感染比較常見。病理剖檢以小腸內壁明顯變薄，腸腔內積滿黃色黏稠液體以及腸壁小腸黏膜絨毛萎縮、壞死為主要特征。這3種病臨床癥狀相似且常有混合感染的情況，給病原的鑒別診斷帶來了一定難度，因此對這3種病原進行準確快速的鑒別診斷，對該病的防控具有重要的意義。本文對此類疫病的病原檢測方法研究進展進行了綜述。

1? 病原學檢測

1.1? 病毒的分離與鑒定

病原的分離鑒定是傳統的檢測方法，常采用細胞培養，雞胚接種和動物接種3種方法分離病原，其中細胞培養是目前分離冠狀病毒的最常用的方法。可用豬唾液腺、豬小腸上皮和豬甲狀腺原代細胞以及Vero、McClurkinST、LIC-PK和豬腎傳代細胞細胞系進行病毒的分離培養，根據病毒在細胞培養中增殖的指標即細胞代謝變化、血細胞吸附（HAd）、干擾現象和細胞病變效應（CPE）評價病毒的感染效果，病毒數量與感染性指標通過蝕斑實驗（PFU）和50%組織細胞感染量（TCID50）進行測定。常用Vero細胞分離PEDV，ST細胞分離TGEV以及LIC-PK細胞分離PDCoV。如任玉鵬等[5]等將疑似感染PEDV病豬病料處理后接種Vero細胞，經連續傳代成功分離到PEDV DY毒株;孫秋燕等[6]利用ST細胞成功分離到兩株TGEV;秦毅斌等[7]利用LLC-PK傳代細胞系分離到一株PDCoV。研究證實，胰蛋白酶、氟林蛋白酶以及TMPRSS2蛋白酶等參與冠狀病毒S蛋白的激活，在冠狀病毒的感染和釋放中起重要作用，因此可通過添加蛋白酶增加相關病毒的分離率[8]。

1.2? 病毒的電鏡觀察

電鏡觀察也是檢測病原常用的方法之一，可通過電鏡負染法觀察病原的分布，在發病期間，病毒存在于病豬的許多器官中。尤其在空腸、十二指腸和腸系膜淋巴結中含病毒量最高。通過電鏡觀察，病毒粒子多分布于胞漿的空泡和腸壁微絨毛間隙，但這3種病原均為冠狀病毒且形態相似，普通透射電鏡觀察時很難區分，需要利用免疫電鏡技術進行鑒別，免疫電鏡技術是一種將含有特殊標記的抗原與抗體相互配對融合，借助特殊電子顯微鏡對抗原做出定位、定性和半定量的技術手段。王繼科等[9]設計出能快速定性PEDV和TGEV且具備3次篩選作用的電鏡技術，施雯[10]對PEDV進行分離培養鑒定，借助普通透射電鏡和免疫電鏡對比觀察，證實其表面具有典型的纖突結構，該方法具有高度精確、快速靈敏等優點，但是需要通過特殊的電鏡儀器，造價昂貴且不適用于大批量的樣本檢測。

2? 免疫學診斷技術

2.1? 血清中和實驗

中和實驗的原理是利用抗原抗體的特異性結合，當兩者結合后會減弱或消滅病毒感染力的實驗。動物受到病毒感染后，體內產生特異性中和抗體，并與相應的病毒粒子呈現特異性結合，可通過檢測病原或產生的相應抗體進行確診。具體操作方法包括豬的接種法和細胞培養法，根據發病或細胞病變的情況判定結果。中和試驗常用的稀釋方法有兩種，一種是固定病毒量與等量系列倍比稀釋的血清混合，另一種是固定血清用量與等量系列對數稀釋的病毒混合。此類檢測方法操作簡單，檢測快速，適用于大批量的樣本檢測，但抗體間存在交叉反應，特異性不強，且因豬從感染病毒到產生抗體需要一定時間，所以也不適用于早期診斷。

2.2? 酶聯免疫吸附實驗

酶聯免疫吸附實驗（ELSA）是用特殊標記抗原或抗體以檢測與之對應的抗體或抗原的微量診斷技術，也是目前實驗室使用最廣泛的檢測方法之一。Rodak等[11]采用PEDV M蛋白的單抗設計出競爭ELISA，結果表明該方法適用于調查分析豬腹瀉病。張清真[12]建立了TGEV雙抗夾心ELASA檢測方法，最低檢測量為17.5 ng/μg，靈敏度高。Thachil等[13]利用PDCoV S1蛋白保守區域作為抗原建立間接ELISA方法。如今還衍生出細胞ELISA和ABS-ELASA等更高效、更快捷的新型檢測技術。該方法雖然具備很好的靈敏度、特異性和穩定性，診斷速度快且適用于大量的血清樣品鑒別分析，但是容易產生交叉反應，造成誤檢。

2.3? 膠體金試紙條檢測技術

膠體金是一種常用的標記技術，是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型技術，目前在檢測中的應用主要是免疫層析法和快速免疫金滲濾法，此方法檢測病原具有簡單、快速、準確和無污染等優點。賈宇旻等[14]等建立了快速檢測豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的膠體金免疫層析方法（GICA），與RT-PCR陽性符合率為93%，檢測快速且對檢測人員無特殊要求，適合豬場腹瀉病原的快速檢測，但檢測結果有待進一步確認。

3? 分子生物學診斷技術

3.1? 聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應是實驗室常用且十分重要的分子生物學技術之一，它是以待檢或需要特定擴增的DNA片段為模板，利用DNA聚合酶的酶促反應，通過特異性引物，經變性、退火和延伸組成一個完整反應周期進行循環復制。由于異物序列與目的基因必須嚴格配對，這也決定PCR方法具有很高的特異性。隨后出現的商品化PCR檢測試劑盒使得該檢測技術在操作上更加簡單、方便和快捷，得到廣泛應用。在實際生產中，人們根據不同需求，運用傳統生物技術結合近代基因工程衍生出熒光定量PCR、原位PCR、巢氏PCR、多重PCR和恒溫隔絕式PCR等一些新型的PCR方法。其中針對M基因、N基因和S基因保守區域設計引物的RT-PCR法是目前臨床應用中最常用的方法，該方法特異性好，成本低，結果準確。韋學雷等[15]針對PEDV、PDCoV和TGEV的M、N、S基因保守區域設計引物，建立了能同時檢測3種病原的多重RT-PCR方法。與單重RT-PCR方法相比，多重RT-PCR方法可實現單次多種病原的同時檢測，省時省力。熒光定量PCR也是近年發展迅速的一門檢測技術，通過在PCR體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，并實現對未知模板定量分析。這種方法克服了傳統PCR易污染和缺乏準確定量的缺點，具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快和全封閉反應等優點，國內外眾多學者建立了多種針對PEDV、TGEV和PDCoV的單重或多重熒光定量PCR方法。如施開創等[16]建立了PEDV、TGEV和PRCoV多重TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法，此方法可快速、高效、準確地對病原實現鑒別診斷，為疾病的早期防控奠定了基礎。除此之外，適用于現場快速檢測的恒溫隔絕式PCR也得到廣泛的應用，這種方法解除了實驗設備及復雜操作的束縛，可實現產房現場快速檢測，實現病原的早診斷、早預防。

3.2? 環介導等溫擴增技術

介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新的體外擴增特定DNA片段的方法。該技術依賴于自動循環的鏈置換反應，在等溫條件下，1 h內即能擴增1×109拷貝的靶序列，核酸研究和病原學檢測等方面得到了廣泛的應用。羅亞坤等[17]建立了豬流行性腹瀉病毒的LAMP檢測方法，在60 ℃恒溫下反應60 min，能特異性地擴增出豬流行性腹瀉病毒的核酸片段，與常規RT-PCR方法的符合率達到97.3%，LAMP檢測方法無需額外的昂貴設備，僅需要水浴或加熱塊在30～60 min內擴增大量核酸且結果易觀察，操作方法簡便、敏感性和特異性高，可以用于相關冠狀病毒臨床病料的快速檢測，但由于其費用昂貴且容易產生氣溶膠污染，在臨床上并未得到廣泛應用。

3.3? 基因芯片、核酸探針雜交技術

基因芯片技術是同時將大量的探針分子固定到固相支持物上，借助核酸分子雜交配對的特性對DNA樣品的序列信息進行高效解讀和分析，如劉志鵬[18]建立了同時檢測PEDV、TGEV、GAR和PDCoV的可視化寡核苷酸芯片，為4種豬腹瀉病毒的同步鑒別診斷提供了一種新的分子診斷技術。核酸探針是將特定標記物通過隨機引物法、PCR法和缺口平移法等標記到某段特定的核苷酸上，與待檢核酸樣品在一定的支持物上進行雜交，然后通過一定顯示系統來探查靶核酸的一種特異性檢測方法。這2種新興技術具有特異性好、靈敏度高和便捷快速等優點，在臨床診斷上具有良好的發展前景。

3.4? 限制性酶切片段長度多態性分析

限制性酶切片段長度多態性分析（Restriction fragmen tlength polymorphism，RFLP）是一種區分具有抗原相關性病毒的有效手段，將抗原性較近的病毒核酸用特定的限制性內切酶進行酶切，然后對酶切的產物進行分析，從而可以達到區分被檢病毒核酸的目的。此方法可以用來鑒別野毒株與疫苗株及強毒株和弱毒株[19]，利于對流行毒株進行精準檢測，以便從分子層面制定防控措施。

4? 討論

豬腹瀉病毒流行廣泛，危害嚴重。與仔豬病毒性腹瀉相關的猜原主要以冠狀病毒為主，包括TGEV、PEDV、PDCoV、PHEV和SADS-CoV，雖然豬的冠狀病毒都有共同的分子生物學特征，但要求對不同的疾病采取有針對性的預防和控制措施。尤其是前3種病毒已在我國豬群中長期存在且污染面廣，由于它們在臨床上都可以引起豬的嘔吐、腹瀉等癥狀，而且都屬于冠狀病毒，難以從臨床癥狀和病原學形態方面加以區分，因此必須通過實驗室診斷而確診，只有開展快速有效的檢測，才能早診斷、早預防，為開展疾病的綜合防控奠定基礎。