金蓮花提取物代謝產(chǎn)物研究△

劉斯琪，趙燦，丁鵬敏，陶志，賡迪，王如峰

北京中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488

金蓮花TrolliuschinensisBunge是毛莨科多年生草本植物，主要分布于西南、西北、華北、東北和臺灣地區(qū)[1]。其干燥花作為中藥金蓮花(Flos Trollii)入藥[2]，味苦，性寒，無毒，具明目、解嵐障的功效，主治口瘡、喉腫、浮熱牙宣、耳疼、目痛[3]。中藥金蓮花中的主要化學(xué)成分包括黃酮、酚酸、生物堿等類成分。其中，黃酮類含量最高，主要為黃酮碳苷，包括葒草苷和牡荊苷及其衍生物[4]；酚酸類成分主要有藜蘆酸、苯甲酸、金蓮酸、原金蓮酸、金蓮花苷等[5-6]；生物堿類成分含量最低，主要為金蓮花堿[7]。中藥化學(xué)成分的體內(nèi)代謝過程對其藥效物質(zhì)的組成有重要影響[8]，而關(guān)于金蓮花化學(xué)成分的體內(nèi)代謝研究卻鮮有報道。由于中藥成分經(jīng)腸吸收最終進入血液的成分較為微量，導(dǎo)致其分析較為困難，許多代謝產(chǎn)物無法被檢測到，而且金蓮花的主要成分為黃酮碳苷類，較難吸收，進一步增加了檢測的難度。為了克服金蓮花入血成分及其代謝產(chǎn)物難以檢測的缺點，采取分步研究的策略較為實際，即先通過靜脈給藥方式研究金蓮花提取物的體內(nèi)代謝輪廓，總結(jié)代謝規(guī)律，在此基礎(chǔ)上再對口服給藥的血液移行成分進行研究。因此，本研究采用高效液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-ESI-MS)對金蓮花提取物靜脈給藥后的血液移行成分進行了鑒定和代謝途徑分析，為后續(xù)的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Waters公司，美國)，Thermo LTQ ORBTTRAP XL質(zhì)譜儀(Thermo公司，美國)，甲酸，乙腈(Fisher公司，美國)。

1.2 實驗動物

清潔級SD大鼠，體質(zhì)量(200±20) g，由北京斯貝福實驗動物科技有限公司提供，合格證編號：SCXK(京)2011-0004。實驗前禁食不禁水24 h。

1.3 試藥

金蓮花藥材(批號：20110901)購自河北省安國藥材市場，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王如峰教授鑒定為毛茛科金蓮花屬植物金蓮花TrolliuschinensisBunge的干燥花。取金蓮花250 g，加12倍量蒸餾水回流提取2次，每次1 h。合并提取液，過濾，減壓濃縮和冷凍干燥后得金蓮花總提取物95.5 g。總提取物加適量蒸餾水溶解并稀釋成50 mg·mL-1的總提取物溶液，供大鼠靜脈給藥用。

2 方法

2.1 色譜條件

Phenomenex Synergi Polar-RP色譜柱(250 mm×4.6 mm，4 μm)，有預(yù)柱；流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸(B)；梯度洗脫(0～12 min，2%～15%A；12～15 min，15%～27%A；15～27 min，27%～45%A；27～30 min，45%～2%A)；流速1.0 mL·min-1；進樣量10 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

Accela 600泵，電噴霧離子源(ESI)，負離子掃描模式，掃描范圍m/z：100～1000。毛細管溫度：350 ℃，毛細管電壓：-35 V，氣化溫度：300 ℃，鞘流氣流量：17 L·min-1。

2.3 給藥及采血

實驗動物按取血時間分為6個時間點，加上空白對照組，共7個組，每組雌雄各1只大鼠。實驗組動物0.004 5 mL·g-1尾靜脈注射給藥，0.003 5 mL·g-110%水合氯醛腹腔注射的方式麻醉，給藥后0、5、15、30、60、90 min下腔靜脈取血。

2.4 樣品處理

各時間點血樣均放置在室溫中，2.5 h靜置凝出血清，5000 r·min-1離心10 min(離心半徑為6.6 cm)，取上清液。雌雄各取0.8 mL血清混合，血清配總提取物組為1.6 mL空白血清，加入50 mg·mL-1總提取物溶液44 μL。上述樣品均分別加入3倍量乙腈混合，沉淀蛋白，12 000 r·min-1離心15 min(離心半徑為5.6 cm)，取上清液。吸取全部上清液，于37 ℃氮氣吹干，再用未吹干前體積的1/20倍甲醇復(fù)溶。超聲溶解2 min，12 000 r·min-1離心15 min(離心半徑為6.6 cm)。吸取上清液備LC-ESI-MS分析用。最終樣品為原血清樣品濃縮的5倍，血清配總提取物的最終檢測質(zhì)量濃度為6.67 mg·mL-1。

3 結(jié)果

各時間點LC-ESI-MS的質(zhì)譜總離子流圖，見圖1。

3.1 原型成分質(zhì)譜裂解規(guī)律分析

根據(jù)LC-ESI-MS數(shù)據(jù)分析了酚酸類、黃酮類、生物堿類原型成分在質(zhì)譜電噴霧離子源(ESI)系統(tǒng)中形成的碎片(表1)，并對其斷裂規(guī)律進行歸納總結(jié)。

酚酸類成分與糖結(jié)合的氧苷易斷裂，會產(chǎn)生葡萄糖醛酸碎片及其互補離子對，同時還會出現(xiàn)脫羧基的碎片等。

黃酮類成分幾乎全部是六碳糖碳苷，其中代表性的碎片為[M-C2H4O2-H]-、[M-C3H6O3-H]-、[M-C4H8O4-H]-、[M-C5H10O5-H]-、[M-C6H12O6-H]-等。葒草素、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、2″-O-(2?-甲基丁酰基)葒草素及6?-HMG-2″-O-β-L-半乳糖苷葒草素等均存在葒草素特征離子碎片m/z357、327，而葒草素-2″-O-β-L-吡喃木糖苷與葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷的結(jié)構(gòu)基本相同，前者在2″連了1個五碳糖，后者連了1個六碳糖，相差1個CH2O，故其離子碎片基本為葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷的特征離子碎片減去1個甲氧基。牡荊素、牡荊素-2″-O-β-L-半乳糖苷等均存在m/z341、311等牡荊素特征離子碎片。2″-O-(2?-甲基丁酰基)牡荊素和3″-O-2-甲基丁酰牡荊素是同分異構(gòu)體，僅甲基丁酰基的位置不同，均存在m/z323、293，即牡荊素特征碎片失去1分子水。同時，2″-O-(2?-甲基丁酰基)牡荊素的特征離子碎片也基本為金蓮花碳苷Ⅲ減去1個甲基。異槲皮素的碎片中存在m/z151.00和311.12，可能是經(jīng)逆狄爾斯-阿德爾(RDA)裂解產(chǎn)生的A1，3-離子碎片。

注：A. 大鼠空白血清；B. 血清配總提取物；C. 0 min含藥血清；D. 5 min含藥血清；E. 15 min含藥血清；F. 30 min含藥血清；G. 60 min含藥血清；H. 90 min含藥血清。圖1 空白血清、血清配總提取物和含藥血清的總離子流圖

表1 原型成分結(jié)構(gòu)式及二級碎片信息

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

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生物堿類原型成分只檢測到了金蓮花堿，樣品中金蓮花堿的提取離子流圖顯示，保留時間為14.9 min，但是這個時間點的提取離子流圖是金蓮花堿的硫酸酯化產(chǎn)物m/z298.04。由于硫酸酯鍵易斷裂，因此在提取離子流圖中就能提到其最大豐度的二級碎片m/z218.08[M-H]-。金蓮花中的金蓮花堿在體內(nèi)的代謝較快，基本被上述提取峰所壓制，故在提取離子流圖中沒有體現(xiàn)。

3.2 代謝產(chǎn)物及代謝規(guī)律分析

酚酸類成分的代謝過程大多為結(jié)合反應(yīng)，如藜蘆酸、金蓮花苷及原金蓮酸的羧羥基可與硫酸酯以酯鍵結(jié)合，也可以同甘氨酸以肽鍵結(jié)合。該羧基還可以發(fā)生還原反應(yīng)，還原為醇羥基后，再進行結(jié)合。除此之外還會發(fā)生O-脫甲基或直接脫甲氧基的現(xiàn)象，O-脫甲基形成羥基后也可發(fā)生與葡萄糖醛酸結(jié)合及上述其他結(jié)合反應(yīng)。金蓮花苷及原金蓮酸都易發(fā)生ω-氧化，金蓮花苷的氧化位置可能為3-位甲氧基，原金蓮酸則可能發(fā)生于C3側(cè)鏈末端或C5位[10]。酚酸類成分代謝途徑見圖2～3，各代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及二級碎片信息見表2。

黃酮類成分代謝過程大多為開環(huán)裂解過程，可能會發(fā)生A型或B型裂解，生成C6-C3及C6-C2型衍生物，其羥基同樣會發(fā)生葡萄糖醛酸、硫酸酯結(jié)合反應(yīng)或羧基還原成醛后發(fā)生甲基結(jié)合反應(yīng)。黃酮類成分代謝途徑見圖4，各代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及二級碎片信息見表3。

金蓮花堿多為葡萄糖醛酸、硫酸酯及甲基結(jié)合反應(yīng)，除此之外也可能發(fā)生雜環(huán)開裂等過程，其代謝途徑見圖5，各代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及二級碎片信息見表4。

注：A.代謝途徑一；B.代謝途徑二。圖2 藜蘆酸體內(nèi)代謝途徑

圖3 金蓮花苷及原金蓮酸體內(nèi)代謝途徑

表2 酚酸類代謝產(chǎn)物及二級碎片信息

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

圖4 黃酮類成分體內(nèi)代謝途徑

表3 黃酮類代謝產(chǎn)物及二級碎片信息

續(xù)表3

續(xù)表3

續(xù)表3

續(xù)表3

圖5 金蓮花堿體內(nèi)代謝途徑

表4 生物堿類代謝產(chǎn)物及二級碎片信息

4 討論

金蓮花中的酚酸基本上是以藜蘆酸和金蓮花苷及其衍生物為主。本研究發(fā)現(xiàn)藜蘆酸和金蓮花苷在體內(nèi)發(fā)生的Ⅱ相代謝[12],以硫酸酯化、甲基化、葡萄糖醛酸化和氨基酸結(jié)合反應(yīng)為主，其中氨基酸一般指的是甘氨酸，這類型代謝產(chǎn)物還會通過酰胺鍵的斷裂再生成新的代謝產(chǎn)物。藜蘆酸Ⅰ相代謝的氧化分為甲氧基末端的ω氧化、芳香環(huán)上加氧成羥基和環(huán)氧化。還原大多指羧基的還原，一般會經(jīng)歷羧基還原成醛最終還原成醇的過程。金蓮花苷的氧化除了甲氧基末端的ω氧化和O-脫甲基等外，還有側(cè)鏈末端的ω氧化、烯鍵氧化和環(huán)氧化。烯鍵氧化一般會產(chǎn)生羧基，再發(fā)生還原，依次生成醛和醇。醛會通過重排生成烯醇，雙鍵環(huán)氧化后最終會水解生成2個羥基。除此以外本研究表明,金蓮花提取物體內(nèi)代謝和單體酚酸體內(nèi)代謝的最大不同在于金蓮花提取物能夠產(chǎn)生兩類酚酸的縮合產(chǎn)物，其中尤以藜蘆酸的羧基還原為醇后易發(fā)生縮合反應(yīng)。

金蓮花中黃酮類成分以碳苷為主，各成分可以通過水解轉(zhuǎn)化，同時其水解反應(yīng)也是黃酮類成分在體內(nèi)的重要反應(yīng)類型。經(jīng)靜脈注射給藥黃酮類成分的主要代謝器官是肝臟，而發(fā)生的反應(yīng)主要是Ⅱ相代謝，包括硫酸酯化、甲基化和葡萄糖醛酸反應(yīng)，這類反應(yīng)使原型成分極性增加，利于排泄或者失活。總結(jié)研究成果發(fā)現(xiàn)，當黃酮母核B環(huán)只存在4′位1個羥基時，易發(fā)生葡萄糖醛酸反應(yīng)，當同時存在3′-和4′-2個羥基時，容易同時發(fā)生甲基和硫酸酯結(jié)合反應(yīng)，或者是甲基和葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)，甲基化一般發(fā)生在3′-羥基。黃酮類成分還會發(fā)生裂解，這類反應(yīng)一般是通過腸內(nèi)菌代謝產(chǎn)生，但是經(jīng)靜脈注射的給藥方式并不經(jīng)過腸代謝，可能的原因是體內(nèi)存在肝腸循環(huán)，能夠使經(jīng)靜脈注射給藥的中藥成分同樣擁有與口服給藥一樣完整的體內(nèi)代謝。本研究中黃酮類成分在體內(nèi)的開裂大多為A型或B型開裂2種，A型開裂部位在C環(huán)的C4和A環(huán)的C5之間，生成C6-C3型(苯丙酸)衍生物和間苯三酚衍生物；B型開裂則發(fā)生于C環(huán)的C3和C4之間，生成C6-C2型(苯乙酸)衍生物，黃酮醇一般發(fā)生B型開裂。黃酮類成分開裂形成的C6-C3型和C6-C2型衍生物和酚酸一樣會在體內(nèi)發(fā)生Ⅰ相和Ⅱ相代謝生成對應(yīng)的代謝產(chǎn)物。

金蓮花堿在體內(nèi)的Ⅱ相代謝也是以甲基化、硫酸酯化和葡萄糖醛酸化為主，其他類型的反應(yīng)應(yīng)該都與其雜環(huán)開裂有關(guān)，雜環(huán)開裂形成的伯胺又易發(fā)生乙酰化反應(yīng)。