響應曲面法優化桑白皮中3個成分的提取工藝△

劉一涵，田云剛，王建霞，郭洪偉，魏華，2*

1.吉首大學 生物資源與環境科學學院，湖南 吉首 416000；2.湖南省土家醫藥研究中心，湖南 吉首 416000

桑白皮為桑科植物桑MorusalbaL.的干燥根皮，由秋末葉落時至次春發芽前采挖根部，刮去黃棕色粗皮，縱向剖開，剝取根皮，曬干后得[1]。桑白皮是一種被廣泛用于治療咳嗽、肝炎、糖尿病、心臟病及其他炎性疾病的傳統藥物[2]。現代藥理研究表明，桑白皮具有抗炎、抗癌、降血脂、抗菌、抗糖尿病、胰脂肪酶抑制、神經保護、抗酪氨酸酶、抗氧化、抗抑郁等活性[2-4]。桑白皮中主要含有Diels-Alder型加合物、黃酮類、多羥基化生物堿、2-芳基苯并呋喃和二苯乙烯等成分[4]。桑酮G、桑酮H、桑辛素為桑白皮中的3個主要活性成分。桑酮G對口腔病原體如變形鏈球菌、血鏈球菌、鏈球菌等具有明顯的抑制作用[3]；桑酮H具有抗人類免疫缺陷病毒(HIV)活性[5]；桑辛素具有抗癌、抗炎、抗驚厥、神經保護、抗氧化和抗HIV等活性[2]。桑酮G、桑酮H、桑辛素生物活性確切，但含量相對較少，其提取制備方法有待提高。為此，本研究采用響應曲面法中心組合設計試驗，并結合HPLC測定含量，對桑白皮中的桑酮G、桑酮H、桑辛素進行提取工藝優化。與正交設計法相比，響應曲面法綜合了試驗設計與數學建模，可獲得響應目標與試驗因素之間明確的函數關系，從而獲得較為精確的最佳工藝參數和響應目標的最優值[6]。因此，本實驗結果具有一定的參考價值和實用價值。

1 材料

1.1 儀器

WJX-800A高速多功能粉碎機(上海緣沃工貿有限公司)；LE204E天平(METTLER TOLEDO公司)；SHIMADZU高效液相色譜，配備Essentia LC-16二元泵、Essentia SIL-16自動進樣器、Essentia SPD-16檢測器、Essentia CTO-16柱溫箱以及Labsolution工作站(島津公司，中國)；R-210旋轉蒸發儀(BUCHI公司)；電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫療儀器有限公司)。

1.2 試藥

桑酮G、桑酮H、桑辛素對照品為實驗室自制，經HPLC檢測，純度分別為97%、98%、96%；乙腈(色譜純，美國天地有限公司)；甲醇、無水乙醇、甲酸(分析純，成都金山化學試劑有限公司)；水為怡寶純凈水。

桑白皮藥材為市面購買，經吉首大學魏華副教授鑒定為桑科植物桑MorusalbaL.的根皮。

2 方法與結果

2.1 3個成分的含量測定

2.1.1色譜條件 色譜柱：WondaCr act ODS-2柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.2%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～27 min，44%B；27～28 min，44%～50%B；28～47 min，50%B，47～48 min，50%～55%B，48～70 min，55%B，70～71 min，55%～100%B，70～81 min，100%B，81～82 min，100%～44%B，82～90 min，44%B)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：265 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。

2.1.2混合對照品的制備 精密稱取桑酮H和桑辛素對照品7.2、4.7 mg，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，配制成質量濃度分別為720、470 μg·mL-1的桑酮H、桑辛素對照品母液。分別取4 mL桑酮H和5 mL桑辛素對照品母液于裝有9.1 mg桑酮G對照品的25 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，最終得桑酮G 364 μg·mL-1、桑酮H 115.2 μg·mL-1、桑辛素94 μg·mL-1的混合對照品。

2.1.3供試品溶液的制備 精密稱取藥材粉末(過二號篩)0.500 g，置具塞錐形瓶中，精密加入不同濃度、不同體積的乙醇，回流提取，提取時間不同，提取溫度不同，冷卻后抽濾，濾液濃縮干后用80%甲醇定容至50 mL量瓶，充分搖勻，取適量過0.45 μm濾膜，即得供試品溶液。

注：A.桑酮G、桑酮H和桑辛素的混合對照品；B.桑白皮供試品溶液；1.桑酮G；2.桑酮H；3.桑辛素。圖1 桑酮G、桑酮H和桑辛素的混合對照品及桑白皮供試品溶液的HPLC圖

2.2 方法學考察

2.2.1線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液，加甲醇稀釋成7個質量濃度的對照品溶液，在2.1.1項下條件進樣測定。以各成分峰面積為縱坐標(Y)，各組分濃度(μg·mL-1)為橫坐標(X)繪制標準曲線，見表1。各成分在相應范圍內線性關系良好。

表1 桑白皮3個成分的線性回歸方程、線性范圍

2.2.2儀器精密度 取同一濃度混合對照品溶液，重復進樣6次，測得桑酮G、桑酮H、桑辛素峰面積的RSD分別為0.25%、0.27%、0.26%，保留時間的RSD分別為0.53%、0.37%、0.27%，表明儀器精密度良好。

2.2.3方法精密度 日內精密度：取同一濃度混合對照品溶液，連續進樣6次，桑酮G、桑酮H、桑辛素峰面積的RSD分別為0.25%、0.27%、0.26%，保留時間的RSD分別為0.53%、0.37%、0.27%，表明日內精密的良好。

日間精密度：取同一濃度混合對照品溶液，重復進樣6次，進樣3 d，測定桑酮G、桑酮H、桑辛素峰面積的RSD分別為0.82%、1.07%、0.91%，保留時間的RSD分別為1.09%、0.66%、0.44%，表明日間精密度良好。

2.2.4重復性試驗 取桑白皮藥材6份，按2.1.3項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下方法測定，桑酮G、桑酮H、桑辛素峰面的RSD分別為1.76%、2.37%、3.46%，表明重復性良好。

2.2.5穩定性試驗 取同一供試品溶液，室溫下放置，按2.1.1項下方法，每隔3 h進一次樣，持續24 h，測得桑酮G、桑酮H、桑辛素峰面積的RSD分別為0.74%、0.99%、0.76%，保留時間的RSD分別為1.11%、0.69%、0.48%，表明供試品在24 h內穩定性良好。

2.2.6加樣回收率試驗 取桑酮G、桑酮H、桑辛素對照品，分別加甲醇稀釋成質量濃度為1.88、0.72、0.47 mg·mL-1的對照品溶液。精密稱定已知含量的桑白皮樣品0.250 g，按所取樣品中3個成分已知含量的80%、100%、120%，取上述各對照品溶液于錐形瓶中，揮干甲醇后，加入稱取樣品，按2.1.3項下方法進行制備，按2.1.1項下方法測定，計算加樣回收率。測定桑酮G、桑酮H、桑辛素的加樣回收率，結果見表2。

表2 桑白皮中桑酮G、桑酮H和桑辛素的加樣回收率試驗結果(n=3)

2.3 單因素試驗

根據表3，分別改變提取溶劑的乙醇體積分數、溶劑體積、提取溫度及提取時間進行單因素試驗，測定桑酮G、桑酮H、桑辛素的含量，考察各因素的影響，結果見圖2。

表3 同步提取桑白皮中桑酮G、桑酮H和桑辛素的單因素試驗設計

結果顯示，隨著乙醇體積分數增加，桑酮G、桑酮H和桑辛素含量逐漸上升，在60%處均達到最大，之后桑酮G和桑辛素含量呈緩慢下降趨勢，桑酮H基本趨于平緩；液料比對桑酮H和桑辛素的提取含量影響均不明顯，隨著液料比從10∶1增加到14∶1，桑酮G含量逐漸上升達到最大值，在14∶1以后，桑酮G含量稍有下降，后趨于平緩；隨著提取溫度升高，桑酮G含量明顯增加，桑酮H和桑辛素含量緩慢增加，到60 ℃達到最大，后三者呈緩慢降低趨勢；在提取80 min時三者含量均達最大。

注：A.乙醇體積分數對桑白皮中桑酮G、桑酮H、桑辛素提取量的影響；B.液料比對桑白皮中桑酮G、桑酮H、桑辛素提取量的影響；C.提取溫度對桑白皮中桑酮G、桑酮H、桑辛素提取量的影響；D.提取時間對桑白皮中桑酮G、桑酮H、桑辛素提取量的影響。圖2 各因素對桑酮G、桑酮H、桑辛素提取量的影響

2.4 響應曲面試驗設計

2.4.1試驗因素與水平設計 根據單因素試驗結果，綜合考慮乙醇濃度、液料比、提取溫度、提取時間對桑酮G、桑酮H、桑辛素含量的影響，選擇以乙醇體積分數(A)、提取溫度(B)和提取時間(C)為主要考察因素，自變量的高低水平用1、0、-1表示，分別以桑酮含量(Y1)、桑酮H含量(Y2)、桑辛素含量(Y3)為響應值，試驗因素及水平值見表4。

表4 桑白皮提取工藝響應面試驗因素及水平設計

2.4.2響應面試驗設計 采用Design-Expert 8.0.6軟件，選擇Box-Behnken法設計試驗，按試驗方案提取桑白皮樣品，計算3個成分的含量，結果見表5。

表5 桑白皮提取工藝響應面試驗設計及結果

2.4.3響應曲面結果分析 利用Design-Expert 8.0.6軟件對表5結果進行多元回歸擬合，得到桑酮G、桑酮H、桑辛素提取含量的回歸模型，見表6，模型回歸系數的顯著性檢驗結果見表7～9。

表6 桑酮G、桑酮H和桑辛素的回歸方程

表8 桑酮H回歸方程的方差分析結果

表9 桑辛素回歸方程的方差分析結果

由表7～9方差分析可知，桑酮G、桑酮H、桑辛素提取的回歸模型均P<0.01，失擬項P值(分別為0.200 5、0.163 1、0.925 1)均大于0.05，表明模型具有極顯著性意義，可充分表示響應值(Y1、Y2、Y3)與3個變量A、B、C的關系；3個模型的多元r分別為0.986 0、0.962 7、0.955 2，表明模型在所研究整個回歸區域內擬合度較好，可用于桑白皮中桑酮G、桑酮H、桑辛素回流提取的含量預測。從表7可以看出，3個因素中，A和B對桑酮G提取含量影響極顯著，C影響顯著，其影響順序為B>A>C；交互項中AB交互作用影響極顯著，二次項中A2、B2影響極顯著。從表8可以看出，對桑酮H提取含量的影響，一次項A和B極顯著，提取時間C不顯著，影響的主次順序為B>A>C；AB交互作用影響極顯著，二次項A2、B2影響極顯著。從表9看出，A和B對桑辛素提取含量的影響極顯著，提取時間C不顯著，影響的主次順序為A>B>C；交互影響因素中AB交互作用極顯著，二次項中A2對桑辛素提取含量影響極顯著。

由分析結果繪制出響應面3D圖(圖3～5)，直觀表現了3個因素交互作用對桑白皮中桑酮G、桑酮H、桑辛素的提取含量的影響。三維曲面圖越陡峭，表示交互作用影響越明顯，三維曲面越平滑，表示交互作用影響越小。分別比較圖3～5中的3組三維響應圖，可知乙醇濃度與提取溫度交互作用對桑白皮中桑酮G、桑酮H、桑辛素的提取含量均最為明顯，而乙醇濃度與提取時間、提取溫度與提取時間2組的交互作用對3個成分的提取含量均影響較小。這與表7～9的方差分析結果一致。

2.4.4驗證實驗 采用軟件優化功能，在Optimization→Numerical→Criteria下，點擊Solutions分別選擇單個優化項，軟件自動根據各項模型方程計算得到各因素最大預測值，預測的桑酮G最佳提取條件：65.75%乙醇，液料比14∶1，71.93 ℃提取107.81 min，提取質量分數為7.13 mg·g-1；桑酮H的最佳提取條件為：64.75%乙醇，液料比14∶1，74.66 ℃提取93.93 min，提取質量分數為1.75 mg·g-1；桑辛素的最佳提取條件：69.14%乙醇，液料比14∶1，100 ℃提取120 min，提取質量分數為1.70 mg·g-1。在Solutions下同時選擇3個優化項，軟件可按照3個成分含量計算的綜合加權評分擬合得到各因素最大值，最終得三者同時提取的最佳工藝：68.64%乙醇，液料比14∶1，74.26 ℃提取110.45 min，提取質量分數分別為桑酮G 7.12 mg·g-1，桑酮H 1.75 mg·g-1，桑辛素1.68 mg·g-1。因進行單個成分提取的含量結果與同時進行提取的含量預測結果相差不大，故選擇同時提取3個成分。考慮到實施提取工藝的可操作性，將同時提取的最佳工藝參數修正為：68%乙醇，液料比14∶1，74 ℃提取110 min。對該工藝進行3次重復驗證，實際測得平均值分別為桑酮G 7.09 mg·g-1、桑酮H 1.74 mg·g-1、桑辛素1.69 mg·g-1，與預測值對比，相對誤差分別約為0.30%、0.41%、0.42%。說明本實驗提供的回歸模型對實際情況的擬合較為真實，證明采用響應面法對桑白皮中桑酮G、桑酮H、桑辛素的提取工藝進行優化，不僅科學實用，而且快速可靠。

圖3 乙醇體積分數、提取溫度、提取時間對桑巴皮中桑酮G提取含量的交互影響圖

圖4 乙醇體積分數、提取溫度、提取時間對桑白皮中桑酮H提取含量的交互影響圖

圖5 乙醇體積分數、提取溫度、提取時間對桑白皮中桑辛素提取含量的交互影響

3 討論

試驗前期對HPLC含量測定條件進行了選擇，比較了甲醇-水、甲醇-0.01%甲酸、乙腈-水、乙腈-0.01%甲酸、乙腈-0.02%甲酸5種流動相，結果發現，采用乙腈-0.02%甲酸作為流動相梯度洗脫，3種成分的分離度高，峰形良好，基線平穩；采用全波長對3種成分進行掃描，發現桑酮G和桑酮H最大吸收波長均為263 nm，桑辛素最大吸收波長為269 nm，最終選擇以265 nm作為檢測波長。

本試驗對提取部位進行了篩選，發現3種成分在桑樹不同部位中含量次序均為葉<枝<桑根白皮<桑根粗皮(桑根粗皮為桑根皮加工時刮下的外層栓皮，桑根白皮為刮去栓皮后的內層白皮)。市售桑白皮一般都會帶有部分外層粗皮，本試驗采用市售桑白皮作為試驗材料。

本試驗考察了提取方法、提取溶劑、溶劑濃度、液料比、提取溫度、提取時間、提取次數7個因素，綜合考慮毒性、試劑回收、提取效率及響應面法的變量要求等，選擇以乙醇濃度、提取溫度、提取時間作為考察因素，利用Design-Expert軟件設計三因素三水平試驗，通過數據分析及模型擬合，結合實際操作，最終確定同時提取桑白皮中桑酮G、桑酮H、桑辛素的最佳工藝：乙醇體積分數68%，液料比14∶1，提取溫度74 ℃，提取時間110 min，該工藝桑酮G得率為 7.09 mg·g-1，桑酮H得率為 1.74 mg·g-1，桑辛素得率為1.69 mg·g-1。此外，本研究建立了同時測定桑白皮中桑酮G、桑酮H和桑辛素的高效液相色譜法。本研究可為桑白皮的有效成分提取、質量控制及開發利用提供參考。