基因傳輸載體綜合實驗設計

程 度， 李曉霞， 喬立紅

（中山大學材料科學與工程學院，廣州510275）

0 引 言

隨著現代生物醫學技術的快速發展，基因組測序、生物信息學以及基因編輯等新技術和新策略不斷涌現，這些技術極大推進基因治療等技術的發展，為腫瘤等重大疾病以及眾多遺傳病的治療提供了有效手段。目前，向細胞內傳輸核酸分子的載體材料主要有病毒載體和非病毒載體兩大類。雖然病毒載體具有傳輸效率高的優點，但其較強免疫原性也限制了其臨床應用。基于高分子材料的基因傳輸載體因其功能多樣性、無免疫原性和基因傳輸效率高的特點，在臨床基因治療方面展示出很好的應用前景。

經過近20 年的發展，根據臨床的需求，高分子材料基因傳輸載體發展出了多種類型的載體材料，不僅滿足了低毒性和生物可降解的臨床需求［1-2］，也發展出具有體內長循環、生理微環境（如pH、還原性、酶）響應性、診療一體化等功能多樣的基因輸送載體［3-6］。而且，隨著生物材料學科的發展，新的基因輸送新技術和載體會不斷涌現，為生物醫學的發展帶來新的變革。為了使學生對基因載體的設計、材料制備方法、納米粒子組裝及其生物功能評價有較為全面的認知和掌握，本文選擇經典的高分子基因載體材料-聚乙二醇-聚乙烯亞胺設計綜合實驗。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI，Mn＝25 kDa），聚乙二醇單甲醚（mPEG-OH，Mn＝2 kDa），溴化氫的醋酸溶液（33%），對甲苯磺酰氯（p-toluenesulfonyl chloride， TsCl ）， N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS），N，N′-二環己基碳二亞胺（dicyclohexylcarbodiimide，DCC），1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（N-Ethyl-N′-（3-dimethylaminopropyl ） carbodiimide hydrochloride，EDC），二甲基亞砜（DMSO），均為分析純，購于Sigma-Aldrich（St． Louis，MO，USA）；其他化學試劑均購于廣州化學試劑廠，用時根據需要經過干燥純化處理或直接使用。透析袋（MWCO：1，3． 5，14 kDa），購于上海綠鳥生物科技公司。MTT 檢測試劑盒購自美國Sigma-Aldrich公司；細胞培養所用胰蛋白酶和胎牛血清（FBS）購自美國Invitrogen 公司（Carlsbad，CA，USA）；人卵巢癌SKOV3 細胞購自中科院上海細胞庫，由本教學實驗室凍存保存。表達綠色熒光蛋白的質粒DNA（pDNA）pcDNA3． 1-EGFP購自上海康朗生物科技有限公司。

1.2 實驗儀器

氫譜1H-NMR：采用VARIAN Mercury-Plus 300 型核磁共振儀進行分析，使用CDCl3作為溶劑。凝膠電泳裝置：EPS-100 電源、HE-120 電泳槽和Tanon-1600成像系統購自上海天能科技有限公司。粒徑和表面電位測定：使用BI-200 SM 動態光散射系統（Brookhaven Instruments，Holtsville，NY），在25 ℃下檢測。散射光以90°檢測，自動加速器上收集。倒置熒光顯微顯微鏡采用徠卡DMi8 （Leica Microsystems Inc．，Buffalo Grove，IL 60089 United States）。CO2細胞培養箱采用377 型號（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）。

1.3 單甲醚聚乙二醇-聚乙烯亞胺（PEG2k ～PEI25k）聚合物的制備

（1）用N，N-羰基二咪唑（CDI）活化單甲醚聚乙二醇（mPEG2k-OH），反應路線如圖1 所示。mPEG2k-OH（4． 0 g）加入到250 mL圓底燒瓶瓶中，70℃條件下真空干燥4 h，加入30 mL四氫呋喃溶解mPEG2k-OH，再后加入3． 2 g （10eq．）的CDI，在氬氣保護下室溫反應24 h后，加入無水乙醚沉淀產物，減壓過濾得到沉淀，干燥得白色粉末狀產物，產率89%。

圖1 PEG-CDI的合成路線

（2）mPEG2k-CDI和PEI25k上的氨基反應制備陽離子兩嵌段聚合物PEG2k-PEI25k，反應路線如圖2 所示。在50 mL圓底燒瓶中用二甲基亞砜（DMSO，20 mL）溶解PEI25k聚合物（1 g），再加入上步制備的mPEG2k-CDI 800 mg （10 eq．），室溫下攪拌反應過夜。所得溶液在純水中透析48 h，每4 h換一次蒸餾水，透析袋規格為：MWCO ＝14 kDa。冷凍干燥后得白色產物，產率83%。

圖2 陽離子聚合物PEG2k-PEI25k的合成路線圖

1.4 負載pDNA納米載體的制備

本綜合實驗所使用的pDNA為表達綠色熒光蛋白的質粒pcDNA3． 1-EGFP，由綜合實驗室提前制備。質粒DNA 溶于TE 緩沖液中，濃度為1 g ／ L。一定量pDNA（如1 μg）加入到已知量的載體聚合物PEG2k-PEI25k的溶液中，按照陽離子聚合物中氨基與pDNA磷酸根的摩爾比（N／ P）為0、0． 5、1、2、4、8、10、20 的條件，將聚合物和pDNA相混合，加入去離子水定容到一定體積，充分混勻后，室溫下振蕩孵育30 min，再靜置10 min，即得不同N／ P條件下載pDNA的納米粒子。

1.5 納米粒子理化性能的評價

（1）粒徑電位的測定。按照1． 4 中的方法制備負載pDNA的納米粒子，用動態光散射系統測定N／ P ＝10 時納米粒子的粒徑和Zeta 電位。溫度25 ℃，入射角45°。每組樣品均取5 次測量的平均值。

（2）聚合物PEG-PEI 復合pDNA 的能力。按照1． 4 中的條件，在不同N／ P 下，將聚合物PEG-PEI 和pDNA充分混勻，將混合溶液加入到含GoldView（DNA染料）的1%瓊脂糖凝膠的加樣孔中進行電泳分析，100 V的電壓下電泳20 ～30 min，電泳結束后，在紫外燈下觀察瓊脂糖凝膠中電泳條帶。

1.6 基因輸送性能的評價

（1）細胞培養。細胞培養基為RPMI 1640 培養基（添加10%胎牛血清和1%雙抗）的，培養條件為37 ℃和5% CO2。當細胞密度達到80% ～90%時，用胰酶（Trysin，0． 25%）消化細胞，進行分瓶傳代。

（2）細胞毒性評價。通過四唑鹽比色法（MTT）檢測納米載pDNA納米粒子對細胞的殺傷作用。細胞以1 × 103／孔的密度接種于96 孔細胞培養板，培養過夜。次日，棄去原有細胞培養基，更換成不含血清的新鮮培養基，加入不同N／ P 條件下制備的載pDNA 納米粒子。進行MTT分析時，棄去原有培養基，加入150 μL不含血清的RPMI 1640 新鮮培養基，加入50 μL MTT溶液（5 mg ／ mL），在37 ℃下繼續孵育4 h，棄去培養孔中的上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩5 min，用酶聯免疫檢測儀（美國國騰）檢測OD570nm處的吸光度值，按照以下公式計算細胞增殖率。

（3）基因表達效率評價。將細胞（密度為1 × 104細胞／孔）接種于24 孔培養板上，加入400 μL 培養基培養過夜。次日，更換為新鮮培養基，加入不同N／ P比下制備的載質粒DNA 的納米粒子，在37 ℃下繼續培養48 h。倒置熒光顯微鏡下觀察細胞表達綠色熒光蛋白的情況。

2 結果與分析

2.1 聚合物材料的制備與表征

將末端羥基PEG接枝到PEI上，需要對PEG上的羥基進行活化。根據綜合實驗的實際情況和需求，采用一種步驟較少和易于操作的方法活化PEG 上的羥基。如圖3（a）所示，首先用CDI 活化PEG，其中化學位移的歸屬如下：δ ＝ 3． 4 （s，3H， CH3—OCH2CH2—），3． 65（s，4H，—OCH2CH2—），4． 6（m，2H—OCH2CH2—O（C ＝O）—，7． 05（s，1H，—CO—NCH ＝CH—N—），7． 40（s，1H，—CO—N—CH ＝CH—N—），8． 12（s，1H，—CO—N—CH ＝N—）。由δ 3． 4 μm 及δ 7． 40 μm 兩處化學位移的積分面積算出端基轉化率為81%。然后再把PEG-CDI 偶聯到PEI上，如圖3（b）所示，在δ 2． 5 ～3． 5 μm 處出現了PEI上—CH2CH2NH—的質子特征化學位移，同時δ 4． 4 μm，δ 7． 05 μm ，δ 7． 40 μm ，δ 8． 12 μm等處的化學位移消失，表明PEG-CDI 已經成功地連接到PEI 上，其中的咪唑基團已經被作為副產物除掉。

圖3 聚合物mPEG2k-CDI（a）和PEG2k-PEI25k（b）的1H-NMR圖譜（CDCls，300 MHz）

2.2 納米粒子的組裝

PEI聚合物具有枝化結構，攜帶有伯胺、腫胺和叔胺（圖4（a）），在pH 7． 4 條件下，部分胺基可質子化，攜帶較強的正電荷，通過靜電相互作用與攜帶負電荷的pDNA組裝形成納米粒。根據不同狀態pDNA在電場下泳動速度和距離的不同，可用凝膠阻滯方法評價PEG-PEI復合pDNA 的能力（圖4（b））。在N／ P≤4時，PEG-PEI 量相對較少，部分pDNA 仍處于游離狀態，形成較窄的DNA電泳條帶。隨著N／ P 的提高，游離pDNA條帶亮度逐漸降低直至消失，而彌散DNA帶型則呈逐漸增加而后消失的現象。其原因在于：隨著PEG-PEI含量的增加，PEI 的正電荷逐步中和pDNA的負電荷，使游離的pDNA減少；當PEG-PEI量仍不足以完全復合pDNA 時，納米粒子上的pDNA 未被完全中和，形成攜帶不同負電荷的納米粒子，從而導致pDNA在凝膠上呈現出彌散的帶型；在N／ P ≥8 時，pDNA帶型完全消失，表明pDNA 的負電荷已被完全中和，pDNA在電場下的泳動被阻滯。

圖4 （a）PEI結構式；（b）不同N／ P比下所制備納米粒子的凝膠阻滯電泳；（c）不同N／ P條件下，所制備納米粒子的粒徑和表面電位；（d）MTT法評價不同N／ P下所制備納米粒子的細胞毒性

但是凝膠阻滯并不能對所形成的納米粒子的表面電位和粒徑給予定量表征，而這些是影響納米粒子轉染細胞效率的重要因素。因此，需要進一步通過動態光散射對PEG-PEI和pDNA所形成納米粒子的表面電位和粒徑進行表征。如圖4（c）所示，在N／ P ＝0． 5時，表面電位和粒徑分別為- 23 mV 和313 nm，表明pDNA未被完全復合和壓縮，導致粒徑偏大和電位偏負；隨著N／ P 增加到4，納米粒子負電位減小直至為0，粒徑呈現減小的趨勢；當N／ P ＞4 時，納米粒子表面電位的正電性逐漸增加，而粒徑逐漸減小；在N／ P 在10 ～20 時，納米粒子表面電位和粒徑則穩定在+ 10 mV和125 nm左右。

由此可見，當PEG-PEI 剛好完全中和pDNA 的負電荷時，并沒有很好地壓縮pDNA，未形成較為致密和穩定的納米粒子；高N／ P 下，納米粒子具有較強的正電位和較小的粒徑，有利于提高細胞轉染效率。但是，較高正電荷會導致明顯的細胞陽離子毒性。因此，需要選擇合適N／ P，合理調控納米粒子的表面電位和粒徑，才能獲得較高的轉染效率。

2.3 基因載體的安全性初步評價

MTT方法是一種簡單實用的評價聚合物細胞安全性的方法，在材料的安全性評價中得到廣泛的應用。如圖4（d）所示，當N／ P ＜2 時，細胞存活率大于90%，與對照組沒有顯著差異，當N／ P ＞10 時，細胞存活率逐漸下降，N／ P ＝20 時，細胞存活率低于50%。

因此，綜合考慮表面電位、粒徑以及細胞毒性等數據，在N／ P ＝8 時制備的納米粒子，具有較為適宜的電位、較小的粒徑和較低的細胞毒性，是較為適宜的載基因納米粒子制備條件。

2.4 基因轉染效率的評價

考察不同特性納米粒子對轉染效率的影響。如圖5 所示，用N／ P ＝8 條件下所制備納米粒子轉染細胞時，表達綠色熒光蛋白的細胞數量最多，而且綠色熒光強度最高；在N／ P ＝0． 5 條件下，所制備納米粒子為負表面電性和較大的粒徑，導致其基因轉染效率降低，表達綠色熒光蛋白的細胞數量最少；當N／ P ＝20 時，所制備納米粒子轉染細胞，雖然表達綠色熒光蛋白的細胞百分比也較高，但是存活的細胞數量明顯降低，這表明納米粒子具有較高的細胞毒性。

3 討 論

PEI的結構單元（—CH2CH2NH2—）含有一個可質子化的氮原子，正電性氨基可有效復合和壓縮質粒DNA，而且仲氨和叔氨在酸性條件下的質子海綿效應發揮破溶酶體的作用，這些因素協同提高了PEI 轉染基因的效率。但是，PEI 強正電荷具有較強的細胞毒性和吸附血液或細胞培養基的蛋白，導致轉染效率的下降［7-8］。PEG是一種無毒和低免疫原性的水溶性聚合物，具有優良的生物相容性，在藥物改性方面有廣泛的應用［9］，PEG修飾可降低PEI的細胞毒性和減少蛋白在其表面的沉積。在PEG修飾改性技術中，采用具有琥珀酰亞胺酯端基、環氧化物端基或醛基端基的活性PEG 修飾PEI 是行之有效的方法［10-11］。但是這些具有特異性端基活性PEG的制備復雜且價格昂貴，限制了其在學生實驗中的應用。端羥基PEG 來源廣泛且價格較低，是較為理想的供學生實驗使用PEG修飾劑。但是羥基的反應活性較低，需要對其進行活化。已有多種文獻報道了活化端羥基PEG的方法，如通過丁二酸酐或馬來酸酐與羥基反應引入羧基，再用DCC ／ NHS活化羧基，再和PEI上的氨基進行酰胺化反應，從而將PEG接枝到PEI［12］。但是該方法操作步驟較多，不利于本科生實驗的開展。二異氰酸酯也可作為端羥基PEG 的活化劑［13］，但要經過多次純化去除干凈二異氰酸酯，才能避免殘余二異氰酸酯和PEI 的副反應，也增加了實驗操作步驟和難度。

圖5 制備納米粒子的粒徑及其分布及轉染細胞的熒光顯微成像（細胞核經DAPI染色后發藍色熒光，GFP蛋白發綠色熒光。圖（d）中的標尺為50 μm）

N，N-碳酰二咪唑（CDI）是一種羧酸活化和甲酰基轉移的試劑［14］，具有反應活性高、反應后處理簡單和易得廉價的特點，常用來合成酰胺類聚合物。與EDC和DCC等同類試劑相比，CDI在學生實驗中具有更高的應用價值。由于咪唑基團的影響，CDI 中的碳酰基具有非常好的甲酰化反應活性，可與羧酸反應生成具有高反應活性的酰基咪唑。酰基咪唑與胺可在非常溫和的條件下生成相應的酰胺［15］，可以應用于多肽的合成。

所設計的綜合實驗選擇操作簡單且易于掌握的方法來實施，便于學生實驗的開展。將實驗分解為載體制備與表征、納米粒子組裝與表征、基因的負載與表征和生物功能評價4 個模塊，較為全面體現了基因載體研究的基本內容。通過該綜合實驗可以使學生對基因載體的制備與評價有較為全面了解，并初步掌握基因載體的研究方法，是對高年級本科生進行科研訓練較為適宜的綜合實驗。

4 結 語

本實驗設計通過CDI 活化PEG 的羥基來制備PEG-PEI聚合物，聚合物和納米粒子表征結果表明，所制備聚合物可以高效負載pDNA，并將pDNA 導入細胞和表達綠色熒光蛋白。實驗設計需要使用核磁、動態光散儀、凝膠電泳和倒置熒光顯微鏡和細胞培養箱等儀器。可使生物材料專業的學生掌握常見基因載體的制備方法，綜合運用材料制備、納米粒子表征和生物評價等方面的知識解決問題，深化對生物材料設計、結構和應用的認識，鞏固理論課所學知識，培養高年級本科生操作能力和研究性科研思維能力，為其后續的學習深造和工作奠定良好的基礎。