原核細胞基因表達調控與產物純化綜合實驗設計與教學實踐

李 欣， 趙玉紅， 趙立青， 李小菊， 張偉英， 石建黨

（南開大學生命科學學院生物國家級實驗教學示范中心，天津300071）

0 引 言

基因表達調控是指生物體內基因表達的調節控制，使細胞中基因表達的過程在時間、空間上處于有序狀態，并對環境條件的變化作出反應的復雜過程［1］。對于真核生物而言，基因表達調控包括轉錄前水平、轉錄水平、轉錄后水平、翻譯水平和翻譯后水平等的調控，而原核生物的基因組和染色體結構簡單，轉錄和翻譯可以在同一時間和位置上發生，其基因表達調控主要在轉錄水平上，而原核表達的主要目的多是為獲得高純度的靶蛋白。基因表達調控是生物體內細胞分化、形態發生和個體發育的分子基礎，作為現代分子生物學研究的中心課題之一，一直是高校生物學科理論與實踐教學的重點和難點［2-4］。

為此，生物國家級實驗教學示范中心（以下簡稱“中心”）分子生物學實驗課程組設計了“原核細胞基因表達調控與產物純化綜合實驗”，并應用于大三年級生物伯苓班開設的分子生物學實驗課程，作為基礎實驗教學內容的補充與拓展。實驗以原核細胞模式生物——大腸桿菌為研究對象，首先利用實時定量PCR技術在轉錄水平上分析IPTG對啟動子活性的調節作用，同時利用免疫印跡技術檢測目的蛋白受IPTG 的誘導表達情況，并最終通過親和層析對表達產物進行純化。該實驗內容由教師科研成果轉化而來，集綜合性和探索性于一身，在幫助學生夯實基礎理論的同時，更加注重培養學生運用所學知識分析問題解決問題的能力，進而為優化分子生物學實驗教學體系，提高生命科學本科實驗教學質量做出了積極嘗試［5］。

1 主要實驗儀器

高速冷凍離心機；常規PCR 儀；RocheLightCycler 480 實時定量PCR儀；NanoDrop 2000C 超微量分光光度計；六一水平電泳裝置；Bio-Rad 垂直電泳裝置；Bio-Rad Mini Trans-Blot SD半干轉印槽；Bio-Rad PowerPac HC高電流電泳儀；金屬浴；恒溫振蕩培養箱；GeneSys Chemi：XR5 凝膠成像系統；超聲破碎儀等。

2 主要實驗材料與試劑

轉化有pGEX-4T-2 ／ GAPDH 質粒的大腸桿菌DH5α；RNAprepPure細菌總RNA提取試劑盒；DNase ／RNase-FreeDeionized Water；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit；LightCycler 480 SYBRGreen ⅠMaster；誘導物IPTG；TE Buffer（pH 8． 0）；實時定量PCR 目的基因擴增引物（上游： 5 ’-GCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3 ’； 下游： 5 ’-CTGGAAAGCTGTGGCGTGATG-3’）；實時定量PCR 內參基因擴增引物（上游： 5 ’-CATGCCGCGTGTATGAAGAA-3 ’； 下游： 5 ’-CGGGTAACGTCAATGAGCAAA-3’）。

30%丙烯酰胺凝膠貯液；分離膠緩沖液（1． 5 mol／L Tris-HCl，pH8． 8）；濃縮膠緩沖液（0． 5 mol／ L Tris-HCl，pH6． 8）；10% SDS；10% AP；TEMED；1 × 電泳緩沖液；2 × SDS-PAGE上樣緩沖液；預染Marker；電轉移緩沖液；100% 甲醇；PVDF 膜；Whatman 3MM 濾紙；PBST；封閉液（5%脫脂奶粉）；鼠源抗GST 抗體；自制的大腸桿菌內源GAPDH 抗體；辣根過氧化物酶偶聯羊抗鼠IgG；ECL化學發光試劑盒；Lysis Buffer；1 × PBS溶液；含30mM GSH 的Tris-HCl（pH8． 0）；GE 親和填料Glutathione Sepharose 4B等。

3 實驗方法

3.1 大腸桿菌的誘導培養

將轉化有pGEX-4T-2 ／ GAPDH質粒的大腸桿菌接種于適量含有80 μg ／ mL氨芐西林的LB 培養基中，37℃，200 r／ min振蕩培養，至OD600達0． 6 ～0． 8 h，分為兩組，其中一組不加IPTG（對照組），另一組加入IPTG至終濃度為1 mmol／ L（誘導組），37 ℃，200 r／ min繼續振蕩培養。

3.2 大腸桿菌總RNA的提取

以RNAprepPure細菌總RNA 提取試劑盒說明書為準。

3.3 RNA檢測

3.3.1 定量檢測

滴加2 μL 待測RNA 于NanoDrop 2000C 超微量分光光度計基座上進行定量。

3.3.2 定性檢測

上樣4 μg待測RNA進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，80 V，30 min。用凝膠成像系統觀察結果。

3.4 反轉錄合成cDNA

按表1 配制反轉錄體系，反轉錄條件設定為：25℃，10 min；42 ℃，60 min；80 ℃，10 min；4 ℃，forever。

表1 反轉錄反應體系

3.5 實時定量PCR

按表2 配制反應體系，反應條件設定見表3。

表2 實時定量PCR反應體系

表3 實時定量PCR反應程序

3.6 蛋白質免疫印跡（WesternBlotting）

3.6.1 SDS-PAGE

在1． 5 mL離心管中加入100 μL 菌液，12 000 r／min離心1 min，棄去上清，收集菌體，在沉淀中加入100 μL PBS 溶液，充分混勻后再加入等量的2 × SDSPAGE上樣緩沖液，混勻后金屬浴上100 ℃加熱20min，并且每隔幾分鐘輕彈盛裝樣品的離心管底部，保證菌體裂解充分；14 000 r／ min 離心5 min，上清液作為SDS-PAGE 的樣品上樣。所用Marker 為預染Marker。電泳電壓120 V，時間1 h。

3.6.2 電泳轉印

（1）根據Marker條帶將凝膠切成理想大小，剪好同等大小的濾紙和PVDF膜；

（2）將PVDF膜放入100%甲醇中浸泡1 ～2 min；

（3）將凝膠、濾紙和PVDF 膜放入電轉移緩沖液中平衡；

（4）在Bio-Rad Mini Trans-Blot SD半干轉印槽中組裝“三明治”結構，轉印槽連接電泳儀，10 V 轉印30 min。

3.6.3 抗體雜交

（1）將PVDF膜置于封閉液中，室溫封閉45 min，PBST洗膜，根據不同目的蛋白位置剪膜，以便孵育不同抗體；

（2）分別孵育鼠源抗GST 抗體和自制的大腸桿菌內源GAPDH抗體（1∶5 000 PBST稀釋），室溫孵育1 h，PBST洗膜；

（3）孵育HRP偶聯羊抗鼠IgG（1∶10 000 PBST稀釋），室溫孵育45 min，PBST洗膜。

3.6.4 成像檢測

（1）將ECL化學發光試劑盒中的A液和B液1∶1配制，PVDF膜上孵育1 min后棄去；

（2）將PVDF膜放入凝膠成像系統，CCD成像。

3.7 蛋白質親和純化

3.7.1 樣品制備

（1）收集菌體：將20 ℃1 mmol／ L IPTG誘導過夜的大腸桿菌4 ℃6 000 r／ min離心15 min，共收集250 mL菌體；

（2）超聲破碎：用20 mL lysis buffer 重懸菌體漩渦混勻后置于冰水混合物中，超聲功率調至200 W，超聲5 s，間歇5 s，循環25 次，直至菌液漸澄清（超聲前后分別對全菌、沉淀和上清留樣，處理方法同3． 6． 1）；

（3）獲得樣品：將超聲裂解液4 ℃14 000 r／ min離心30 min，上清經0． 45 μm濾膜過濾即獲得樣品。

3.7.2 親和純化

（1）將GE親和填料1 mL 裝入層析柱，用10 倍柱體積的ddH20 洗滌；

（2）用10 倍柱體積的PBS溶液平衡柱子；

（3）將離心得到的上清液加入柱子，堵上堵頭，使上清與填料4 ℃旋轉混合1 h；

（4）將堵頭去掉，填料自然沉降，收集流穿液；

（5）用5 倍柱體積PBS 過柱子洗雜，收集洗雜液（每毫升依次取樣）；

（6）用3 倍柱體積含有30 mmol／ L GSH 的PBS溶液洗脫，收集洗脫液（每毫升依次取樣）；

（7）將上述收集液分別與2 × loading buffer 混合煮樣后離心，進行SDS-PAGE檢測。

4 實驗結果與分析

4.1 轉錄水平上分析IPTG 對啟動子活性的調節作用

4.1.1 大腸桿菌總RNA的提取與檢測按實驗方法3． 1 將大腸桿菌誘導培養1 h 后，對照組和誘導組分別提取總RNA，并進行定量檢測，結果如圖1 所示。圖1 表明，提取的大腸桿菌總RNA濃度較好，分別為532． 1 ng ／ μL（對照組）和754． 0 ng ／ μL（誘導組），但A260 ／ A280 比值略高于2． 0，說明提取純度不甚理想，可能是試劑殘留或RNA部分降解造成的。為此還需進一步通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA 的提取質量進行定性檢測，結果如圖2。

大腸桿菌總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，理論上應該看到23S、16S 和5SrRNA3 條帶。根據圖2 結果中的條帶數量、帶型和亮度，說明總RNA 的提取質量良好。

圖1 大腸桿菌總RNA定量檢測結果（上：對照組；下：誘導組）

圖2 大腸桿菌總RNA 定性檢測結果（左泳道：對照組；右泳道：誘導組）

4.1.2 實時定量PCR分析IPTG對啟動子活性的調節作用

對提取的對照組和誘導組RNA 按實驗方法3． 4進行反轉錄合成cDNA分別作為實時定量PCR 模板，對內參基因即大腸桿菌內源16SrRNA，和目的基因即外源GST-GAPDH 按實驗方法3． 5 各自進行擴增，引物與模板對應關系如表4 所示，共4 組反應，每組反應3 個重復，擴增曲線呈現較為完好的“S”形（見圖3），符合定量檢測要求。

表4 實時定量PCR各組模板與引物對應關系

圖3 實時定量PCR擴增曲線

本實驗選用染料法，因此需要通過各擴增產物的熔解曲線來考察產物的特異性，如圖4 所示。從圖中可以看出，讀板溫度設為78 ℃時，擴增產物的熔解曲線分別在目的基因和內參基因Tm 處只有單一峰，表示擴增特異性良好，無非特異性擴增。

圖4 擴增產物熔解曲線

在此基礎上選擇相對定量分析模式，誘導組經過對照組均一化處理，計算結果如表5 所示。

表5 實時定量PCR相對定量結果

結果表明，經內參基因校正后，誘導組目的基因mRNA水平是對照組的5． 603 倍，即經過1 mmol／ L IPTG誘導后，在轉錄水平上啟動子活性即利用效率明顯提高，是未經誘導時的5． 603 倍。

4.2 翻譯水平上檢測目的蛋白受IPTG的誘導表達

按實驗方法3． 1 將大腸桿菌同樣誘導培養1 h后，按實驗方法3． 6 進行免疫印跡實驗，在一抗孵育前，將PVDF膜上下剪開，上膜用鼠抗GST抗體對外源目的蛋白GST-GAPDH 進行檢測，下膜用自制的大腸桿菌內源GAPDH抗體對內參蛋白GAPDH進行檢測，CCD系統成像結果如圖5 所示。

免疫印跡結果表明，經過1 mM IPTG 誘導后，誘導組外源目的蛋白GST-GAPDH的表達量明顯高于對照組，且內參蛋白GAPGH 的檢測證明這種差異并非由上樣量不均而引起，說明IPTG 的誘導可在翻譯水平上顯著提高目的蛋白表達量。值得一提的是，理論上目的蛋白和內參蛋白可以用相同的GAPDH 抗體檢出，但因兩種蛋白來源上的差異，本實驗選擇了兩種不同的抗體來保證檢測效果。

圖5 免疫印跡CCD系統成像結果

4.3 目的蛋白親和純化

按實驗方法3． 7 對靶蛋白GST-GAPDH 進行親和純化，結果如圖6 所示。

圖6 親和純化結果

從泳道1 ～3 可見，目的蛋白表達量較高，且可溶性蛋白居多；泳道4 ～6 表明目的蛋白純化效果良好，幾乎無雜蛋白；但因親和填料飽和或與蛋白作用不充分，導致7 ～9 泳道即流穿液中也有較多目的蛋白，后續實驗需增加填料，或延長填料與蛋白孵育時間。

5 實驗教學設計與實踐

5.1 課堂教學

本實驗內容綜合性和連貫性強，對于本科生而言，操作難度大，失誤率高，為不增加學生負擔的同時保障教學效果，實驗首先面向學有余力的大三年級生物伯苓班開設。“伯苓班”是南開大學入選的國家“基礎學科拔尖學生培養試驗計劃”的生物學科人才培養試點班。大三年級生物伯苓班學生已經具備分子生物學理論和操作基礎，且均有進入實驗室參與科研活動的經歷，因此，將本項目作為綜合性實驗開設，學生探索為主，教師指導為輔，以科研微課題的形式讓學生自主安排時間完成。過程中任課教師定期組織教學討論，并隨時答疑。實驗結束后要求學生以科研論文的形式撰寫實驗報告，并分組進行實驗結果展示與匯報。任課教師綜合過程表現、實驗報告和展示情況給出最終成績。上述教學模式充分突出了學生的學習主體地位，旨在充分激發學生的科研興趣，著重培養學生獨立分析問題、解決問題的科學思維和實踐能力［6-7］，受到伯苓班學生的廣泛認可與好評。

5.2 實踐拓展

本實驗內容是對基礎分子生物學實驗教學內容的補充與延伸，因此對于其他涉及分子生物學學習的專業來說同樣具有實踐價值。但由于受到學時有限、實驗成本較高、學生基礎參差不齊等諸多因素的限制［8-9］，擴大本實驗項目的課堂教學受眾面尚有一定困難。為此，課程組將其中的關鍵部分通過虛擬仿真技術呈現出來，除了模擬按部就班的實驗操作以外，還著重突出了如下兩點：一是將實驗涉及的理論和技術原理制作成3D動畫（見圖7 ～10），通過動畫的生動演示將微觀變為可視，將抽象變為直觀，將靜態變為動態，能夠有效幫助學生理解相應知識點；二是在多個實驗環節中設計了常規教學無法平行開展的多樣化實驗方法以達到同一實驗目的，使學生在充分體驗“條條大路通羅馬”的同時拓展實驗思路，如Western Blotting部分中，電泳轉印除了實驗中用到的半干轉，還有濕轉法（見圖11），而蛋白質親和純化除了填料法以外，蛋白質層析系統配合預裝柱同樣是科研中的常用手段（見圖12）。采用虛實結合的教學模式，不僅可以拓展實驗本身的廣度和深度，尤其對于尚無條件開展完整實驗的相關院校和專業，更能夠有效彌補實體實驗教學的不足，促進教學質量的提升［10-11］。

圖7 “基因表達調控”原理動畫界面

圖8 “Western Blot”原理動畫界面

圖9 “實時定量PCR”原理動畫界面

圖10 “目的蛋白親和純化”原理動畫界面

圖11 電泳轉印（左：濕轉；右：半干轉）

圖12 蛋白純化（左：填料法；右：蛋白質層析系統）

6 結 語

基因表達調控是分子生物學教學任務中的重要組成部分，讓學生深入理解其基本內容，形成分子生物學基本思維方式和研究方法是教學實踐的重要目標［12-13］。為此，中心分子生物學實驗課程組設計了“原核細胞基因表達調控與產物純化綜合實驗”作為對基礎實驗教學內容的補充。實驗是在1 mmol／ LIPTG誘導下對大腸桿菌轉錄水平和翻譯水平分別進行了檢測。結果表明，經誘導，大腸桿菌啟動子活性明顯提高，目的蛋白表達量顯著增加，并可通過親和層析獲得純度較高的靶蛋白。實驗內容上環環相扣，不僅讓學生掌握基因表達調控相關的常用實驗方法，提高學生的動手實踐能力，更培養了學生系統的科研思維以及嚴謹的科研素養。在教學實踐中，實驗以實體課堂授課模式為主線，并輔以虛擬仿真技術，可滿足不同學習條件、學習基礎和學習需求的受眾，對于增強學生的自主學習意識，推進實驗教學模式多樣化，提高本科實驗教學水平和人才培養質量發揮了積極作用［14-16］。