在線固相萃取液質聯用技術的實驗教學探索

楊麗萍， 虞俊超， 宋曉靜， 王雁南， 崔玉曉， 姚青倩， 劉慶龍， 展思輝

（南開大學環境科學與工程學院，天津300351）

0 引 言

實驗教學相對于理論教學更加直觀，是培養學生知識創造能力、應用能力和創新實踐能力的重要環節［1］，應該與科研工作的實際過程緊密結合，從現實問題出發，一步步建立實驗方案，向學生展示獲得準確、可靠科研數據的過程，以達到“授人以漁”的教學目的。隨著科研和教學條件的改善，一些實驗操作流程復雜、數據分析簡單的儀器正在逐漸被實驗操作智能化、數據分析復雜的大型精密儀器所取代。不僅開展實驗教學的硬件條件得到極大改善，實驗教學的內容也不再停留在單一、重復性實驗上，將科研訓練融入教學實踐、能夠激發學生參與科研活動積極性的綜合型實驗正在逐步成為各大高校實驗教學改革的重要教學手段［2-4］。

液質聯用儀廣泛用于分析化學、環境檢測、藥物代謝等各個領域［5-7］，越來越多的高校將這種儀器用于實驗教學，以拓寬學生的知識面。但由于液質聯用儀對上機分析的樣品要求嚴格，傳統的樣品前處理不僅操作繁瑣、耗時，而且有機溶劑消耗量大，產生大量廢液，不利于實驗操作者的身體健康，也對環境造成了污染，因此液質聯用儀實驗教學很少包括樣品前處理過程，這造成了教學與科研工作的脫節，不利于學生在實驗教學中形成感性認識，也削弱了實驗教學“學以致用”的作用。隨著實驗技術的發展，在線固相萃取系統以其自動化程度高、重現性好、防污染等優勢，廣泛應用于高校、科研機構［8-11］以及一些從事痕量分析的機構（如出入境檢驗檢疫局）［12］。由于在線固相萃取系統省時、高效、污染小，將其用于實驗教學，不僅有助于學生掌握先進實驗技術，也能夠完整呈現科研工作開展的流程，激發學生的學術志趣。

我校環境科學與工程學院在研究生現代儀器分析實驗課程中，開設了在線固相萃取液質聯用儀檢測水中雙酚類物質的實驗。該實驗以大型精密儀器為教學平臺，結合環境領域研究熱點，系統地向學生展示在建立難揮發的有機物檢測方法過程［13］，同時，通過綜合實驗設計讓學生了解在線固相萃取系統的工作原理，熟悉并掌握這項前處理技術，拓展學生的視野，培養學生的科研能力，為解決實際問題打好基礎。

1 實驗原理

雙酚類化合物（Bisphenol Compounds，BPs）廣泛應用在合成聚碳酸酯、環氧樹脂、聚醚和聚酯等領域，是合成高分子材料的重要單體。其中，雙酚A（BPA）是公認的典型環境內分泌干擾物，其生產和使用在美國和加拿大等國家受到了限制或禁止之后，雙酚A（BPA）的替代品包括雙酚B（BPB）、雙酚C（BPC）、雙酚E（BPE）、雙酚F（BPF）、雙酚S（BPS）、雙酚Z（BPZ）、雙酚AF（BPAF）和雙酚AP（BPAP）的生產和使用在急劇增加。

目前，水體中雙酚類物質可以通過液相色譜法、氣質聯用法及液質聯用法進行分析，但由于這些方法采用離線固相萃取技術對水中的目標物進行富集和凈化，操作復雜，耗時較多，不適用于實驗教學。本實驗針對環境水樣，利用在線固相萃取液質聯用技術，通過優化在線固相萃取條件，在15 min內完成BPA及其8種替代品的定性定量分析，實現樣品準確、快速的檢測。

2 實驗材料和儀器

2.1 儀器

超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜聯用儀（Waters Xevo TQ-S，含全自動在線固相萃取（OA-SPE）系統）。

2.2 材料與試劑

標樣信息：BPA（99%）、BPS（99． 7%）、BPAF（98%）購自日本TCI 公司，BPF（99． 9%）購自德國Dr． Ehrestorfer 公司，BPAP（99%）、BPB（98． 4%）、BPC（98%）、BPE（99%）和BPZ（98%）的標準品均購自美國AccuStandard公司。

試劑甲醇、乙腈均為色譜純（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）。實驗全過程使用Milli-Q 超純水（機器型號Milli-Q Reference A +）。

3 方法與結果

3.1 在線固相萃取條件及洗脫程序

本實驗在OA-SPE 系統加入了溫度控制元件，考察30 ℃和45 ℃下在線固相萃取系統的效率。通過大體積的自動進樣針取5 mL 水樣至OA-SPE 系統進行在線固相萃取，由四元溶劑管理器（QSM）用溶劑對SPE柱進行目標物富集及干擾物清洗，過程見表1，然后通過閥的切換，由二元溶劑管理器（BSM）對目標組分進行梯度洗脫，經液相色譜質譜系統，對樣品進行分析。

表1 在線固相萃取流量梯度程序

QSM 流動相A 為0． 1%（V／ V）氨水水溶液，B 為0． 1%（V／ V）甲酸水溶液，C 為甲醇，D為純水，在線固相萃取柱型號Waters HLB Direct Connect HP 2． 1 × 30 mm，20 μm，可循環使用。

3.2 色譜條件及質譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH Shield RP18（2． 1× 150 mm，1． 7 μm，Waters），柱溫55 ℃，BSM 流動相的流速0． 3 mL／ min，其中A為0． 1%（V／ V）氨水，流動相B為甲醇，流動相梯度淋洗程序：0 ～3 min，20% B；3． 1 ～7 min，20% ～40% B；7． 1 ～10 min，40% ～80%B；10． 1 ～11． 1 min，100% B；11． 1 ～15 min，20% B。質譜條件采用電噴霧離子源的負離子模式（ESI-），多反應監測掃描模式（MRM），離子源溫度和去溶劑溫度分別為120 ℃和350 ℃，毛細管電壓為2． 5 kV，去溶劑氣（氮氣）流速700 L／ h，錐孔氣（氮氣）流速150 L／h。9 種目標分析物質譜檢測參數見本課題組前期研究成果［14］。

3.3 試樣制備

用針式過濾器取水樣經0． 22 μm 混合纖維素酯微孔濾膜過濾后轉移至20 mL樣品瓶，置于自動進樣盤中待進樣。

4 結果與分析

4.1 在線固相萃取溫度的選擇

固相萃取柱溫度由30 ℃上升至45 ℃，9 種目標物的色譜峰面積沒有顯著差異，但出峰時間都略有提前，色譜峰變窄，峰形對稱性變好，其中以BPS 最為顯著。如圖1 所示，固相萃取柱溫度由30 ℃上升至45℃時，BPS出峰時間提前了約0． 3 min，峰寬由大于0． 5 min變為0． 1 min，峰形得到極大優化。實驗結果表明，固相萃取柱溫度為45 ℃時，在線固相萃取系統對9 種雙酚類物質的富集及洗脫效果較好。

圖1 不同富集溫度下BPS的色譜圖

4.2 在線淋洗條件的選擇

在線萃取時，比較了從0． 1%氨水水溶液、純水及0． 1%甲酸水溶液的淋洗條件。圖2 所示對比了9 種BPs在3 種淋洗條件下的峰面積，結果表明，除BPS外，純水淋洗的峰面積都顯著低于另外兩種淋洗條件。使用0． 1%甲酸水溶液的淋洗時，BPS 峰面積略低于純水淋洗時獲得的峰面積；使用0． 1%氨水水溶液淋洗時，BPS 峰面積僅為純水淋洗獲得峰面積的4%。這可能是由于BPS 的分子結構中有一個吸電子能力很強的砜基，其酸性比其他BPA 替代品更強，因此堿性淋洗條件不利于BPS 在固相萃取柱上保留造成的。綜合考慮9 種BPs在3 種淋洗條件下的表現，最終采用0． 1%甲酸水溶液對固相萃取柱進行淋洗，將固相萃取柱上保留較弱的雜質淋洗下來，同時保留雙酚類化合物，洗脫條件見表1。

圖2 不同淋洗條件下9種BPs的峰面積

4.3 定量分析

水體中雙酚類化合物的濃度大部分在0． 01 ～100 ng ／ L的范圍內［15］，因此本實驗采用超純水配制不同濃度梯度（0，0． 001，0． 01，0． 05，0． 10，1． 0，5． 0，10，100 ng ／ L）的混合目標物系列溶液，并取20 mL 各個濃度的混合標準溶液轉移至對應的20 mL自動進樣瓶，經在線固相萃取后，進入LC-MS系統分析。以3 倍信噪比（S ／ N）對應的添加水平作為檢出限（LOD），10 倍信噪比（S ／ N）對應的添加作為定量限（LOQ），9 種目標物的線性范圍、LOD及LOQ見表2。

表2 目標分析物的線性范圍、回歸方程、相關系數、檢出限和定量限

5 結 語

當前各高校的液質聯用實驗教學均偏重考證方法學，包括驗證線性、精密度、穩定性和重現性的實驗，而忽視了實際科研中占用大量時間的樣品前處理的教學工作。造成這一現象的主要原因在于樣品前處理耗時、操作復雜，實驗工作量大，由于課時限制，無法與大型儀器實驗課銜接。針對這一現象，本實驗在前期科研課題研究的基礎上，根據儀器分析實驗教學任務和課時的安排，建立了在線固相萃取-超高效液相色譜串聯質譜法測定地表水中雙酚A 及其8 種替代物的測定方法。該方法簡便、快捷，無需手動進行復雜的前處理，且樣品富集倍數高，實驗結果準確。考慮到實驗耗時，每組在完成色譜、質譜檢測方法建立實驗［13］之后，在富集溫度和在線淋洗條件的實驗中選擇其一，每兩組實驗相互補充、完成全部實驗內容，學生自主完成樣品檢測，實驗所得數據兩組共享，使學生同時了解富集條件、色譜條件以及質譜檢測條件對實驗結果的影響。本實驗基于目前環境領域研究熱點雙酚類物質，融合了色譜、質譜等領域的知識，豐富了實驗課程內容，使學生體會到先進實驗技術對解決實際問題的推動作用，深刻認識科學研究的流程，有助于激發學生學習興趣，提升學生操作技能和創新能力。