測定肉串源性成分的液相色譜-串聯質譜與聚合酶鏈式反應方法對比研究

張穎穎 李瑩瑩 范維 齊婧 李慧晨 王守偉

摘 要：采用液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）與聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）方法分別對北京市場中的200 個烤肉串樣品進行源性成分分析。其中PCR方法按照出入境標準進行操作，LC-MS/MS方法為自建方法，原理是基于測定物種的特異性多肽鏈進行物種鑒別。結果表明：2 種檢測方法所得到的結果一致，肉串總體摻假比例為21%，其中羊肉串摻假比例為28%，牛肉串摻假比例為14%，主要摻假物種為豬和鴨;通過大批量樣品實驗對比，LC-MS/MS方法的準確性更高，實驗操作也更為簡便、耗時短、成本低，可用于日常食品的肉源性成分檢測。

關鍵詞：肉串;聚合酶鏈式反應;液相色譜-串聯質譜;肉源性成分

Abstract： In this paper， liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） and polymerase chain reaction （PCR） were comparatively used to analyze the animal species of 200 samples of meat skewer sold in the Beijing market. The PCR method was operated in accordance with the entry and exit inspection and quarantine standards， and the LC-MS/MS?method was established in our laboratory based on the determined species-specific peptides. The results obtained by the two methods were exactly consistent with each other. The adulteration rate of the meat skewers was 21%， and 28% of lamb skewers and 14% of beef skewers were found to be adulterated. The main adulterants were pig- and duck-derived ingredients. This study further showed that the LC-MS/MS method had the advantages of higher accuracy， easier operations， shorter time consumption， and lower cost than PCR. It can be used for the detection of the animal species of common meat products.

Keywords： meat skewer; polymerase chain reaction; liquid chromatography-tandem mass spectrometry; animal species

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200512-119

中圖分類號：TS207.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）07-0070-08

引文格式：

張穎穎， 李瑩瑩， 范維， 等. 測定肉串源性成分的液相色譜-串聯質譜與聚合酶鏈式反應方法對比研究[J]. 肉類研究， 2020， 34（7）： 70-77. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200512-119.? ? http：//www.rlyj.net.cn

ZHANG Yingying， LI Yingying， FAN Wei， et al. Comparison of liquid chromatography-tandem mass spectrometry and polymerase chain reaction for determination of the animal species of meat skewers[J]. Meat Research， 2020， 34（7）： 70-77. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200512-119.? ? http：//www.rlyj.net.cn

目前，食品摻假已成為全球性問題，涉及多個食品種類，包括肉類食品[1]、血液[2]、阿膠[3]、乳制品[4]、水產品[5]等。最為常見的摻假方式是經濟利益驅動的摻假，即用低價原料替代高價原料。燒烤如今已成為一種休閑娛樂方式，由于牛羊肉價格較高，商家常用鴨肉、豬肉、雞肉來替代。摻假羊肉串多采用鴨肉，因其肉色更加接近羊肉，呈暗紅色，將鴨肉在羊油中浸泡一段時間，可以得到與羊肉外觀相似的假羊肉。也有部分商戶用豬肉來炮制“假肉串”，但新鮮豬肉的色澤呈鮮紅色，在造假過程中，商販們會選擇利用紅曲紅、番茄紅等天然色素，甚至是胭脂紅等合成色素來調配“假肉串”的外觀顏色，而食用過量色素將會損害人體生殖系統和神經系統，對肝臟代謝也會造成阻礙。目前測定食品摻假的主要方法包括酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）、質譜等方法。ELISA方法是基于抗原與抗體特異性結合進行測定[6-7]，但由于蛋白質在加工過程中易發生變性，且物種間易產生交叉反應[8]，因此該方法的準確性有待進一步提升。PCR方法是目前應用最廣的肉類摻假檢測方法，該方法通過擴增物種基因來進行判定，準確性高、靈敏度強。隨著國內外大量研究的進行，PCR技術也在不斷發展，如雙重液滴數字PCR[9-10]檢測技術可以同時識別和量化樣品中所含的牛肉、豬肉等。此外，檢測靶標基因也不斷優化改進，已建立基于COⅠ基因[11]的基因條碼檢測技術，實現對肉制品中牛、豬、羊、鴨源性成分的鑒別。基于哺乳動物線粒體基因[12]，構建了馬、牛、豬、鴨四重PCR體系。但是PCR方法也存在一系列問題，如對于深加工肉制品而言，DNA易降解[13-14]，易受環境污染等。質譜法通過測定不同物種的特異性多肽鏈進行物種鑒別，相比于DNA序列，蛋白質的氨基酸序列在肉制品加工過程中更加穩定[15]，此外質譜法的操作性強、準確性高，可同時測定多個物種，在豬[16]、牛[17]、雞[18]、馬[19]、鴨[20]、羊[21]等加工產品中表現出更好的鑒別能力，因此在食品摻假檢測方面被廣泛研究與應用。Orduna等[22]使用四極桿軌道阱質譜測定肌紅蛋白、肌球蛋白-1、肌球蛋白-2和β-血紅蛋白中的標記肽，鑒別肉制品中的豬、馬、牛、羊源性成分。Motta等[23]使用酪蛋白多肽作為生物標記物測定牛乳摻假。Yang等[24]使用高分辨率質譜分析溶解在碳酸氫銨緩沖液中并用胰蛋白酶酶解的明膠樣品，通過結合使用高分辨質譜與串聯質譜分析，檢測和鑒定豬Ⅰ型膠原多肽，結果表明該方法靈敏度高，檢出限低至0.1%。Prandi等[25]從α2-膠原蛋白鏈中提取出針對牛、豬的生物標記肽，利用超高效液相色譜-串聯質譜技術測定肉醬中牛、豬源性成分的含量。Montowska等[26]建立了一種液體萃取表面分析質譜方法，用以測定肉制品中牛、豬、馬、雞和火雞源性成分。

本研究針對當前肉串市場的摻假現象，分析北京燒烤市場中的大量樣品，樣品來源包括小吃店、餐廳、市場、超市等多個環節，涉及16 個區縣、共200 份樣品，對比采用2 種方法對所有樣品進行肉串源性成分鑒別：基于蛋白質組學的液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）方法和基于相關標準的PCR檢測方法。其中LC-MS/MS方法是本研究建立的物種鑒別方法，該方法先利用Thermo Q Exactive HF-X液相色譜四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜及Proteome Discoverer（PD）軟件進行物種特異性多肽鏈的篩選，通過進一步數據轉化分析，建立測定豬、牛、羊、雞、鴨源性成分的LC-MS/MS方法。每份樣品均采用2 種方法進行測定，通過對比實驗操作過程及結果分析，進一步驗證LC-MS/MS方法的準確性及可操作性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

于北京市場購置羊肉串100 份、牛肉串100 份，涉及昌平區、大興區、朝陽區、東城區、房山區、豐臺區、海淀區、懷柔區、門頭溝區、密云區、平谷區、石景山區、順義區、西城區、延慶區、通州區16 個區縣的農貿市場、超市、餐館、小吃攤等多個流通領域，包括生、熟制品。樣品購置后用均質器攪碎混勻，均分為2 批 ，一批用于PCR方法檢測;另一批用于LC-MS/MS方法檢測。

組織基因組DNA提取試劑盒 廣州迪奧生物科技有限公司;2×PCR Premix Ex TaqTM 大連寶生物科技有限公司;2×Taq PCR MasterMix（含染料） 大連索萊寶生物科技有限公司;DNA Marker Ⅱ 天根生化科技（北京）有限公司;胰蛋白酶（測序級）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）（生化級） 美國Promega公司;碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）（生化級） 美國Sigma公司;甲酸、乙酸、乙腈（色譜純） 德國Merck公司;HLB固相萃取柱 美國Waters公司;尿素、硫脲、鹽酸（分析純） 國藥集團化學試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

FTC-3000P實時熒光PCR儀 加拿大Funglyn公司;TC-5000 PCR儀 北京瑞爾欣德科技有限公司;D30微量核酸蛋白測定儀 美國Bio-Tek公司;3-30K臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司;DK-80恒溫金屬浴?上海一恒儀器有限公司;Thermostat plus振蕩器、Q Exactive HF-X液相色譜四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜系統（配有電噴霧離子源）、TSQ超高效液相色譜-串聯質譜儀（配有電噴霧離子源） 美國Thermo公司;固相萃取裝置 美國Agilent公司;CR22N高速冷凍離心機 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 PCR方法

PCR檢測方法采用現有標準方法。豬、牛、羊源性成分的測定：參照SN/T 2051—2008《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法 實時PCR法》[27];雞源性成分的測定：參照SN/T 2978—2011 《動物源性產品中雞源性成分PCR檢測方法》[28];鴨源性成分的測定：參照SN/T 3731.5—2013《食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第5部分：鴨成分檢測 PCR法》[29]。DNA提取按照試劑盒說明書進行;引物探針來自各標準，由上海英濰捷基科技有限公司合成。詳細實驗操作過程及反應程序見各標準。

1.3.2 LC-MS/MS方法

1.3.2.1 樣品制備

根據前期實驗[30-31]，將樣品前處理過程分為蛋白提取、酶解、凈化3 個步驟，具體操作簡述如下：準確稱取2 g均質后樣品，加入20 mL蛋白提取溶液（含7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、0.05 mol/L Tris-HCl，pH 8.0），均質，12 000 r/min離心20 min;取200 ?L上清液于4 mL離心管中，加入20 ?L 5 mmol/L DTT溶液，56 ℃反應1 h;加入23 ?L 100 mmol/L IAA溶液，暗處反應0.5 h;加入28 ?L 5 mmol/L DTT溶液，暗處反應15 min;加入1.8 mL稀釋溶液（25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0），混勻后，加入50 ?L 1.0 mg/mL胰蛋白酶溶液，37 ℃過夜反應;酶解反應結束后，加入適量體積分數5%的TFA水溶液，使得溶液pH值小于2.0，以終止酶解反應;將樣品上樣至已活化的C18固相萃取柱（分別用乙腈、體積分數50%乙腈水溶液、體積分數0.1% TFA水溶液活化），分別用體積分數0.1% TFA水溶液、體積分數0.5%乙酸淋洗，用2 mL乙腈-0.5%乙酸（60∶40，V/V）洗脫，過0.22 ?m濾膜后上機。

1.3.2.2 LC-MS/MS分析

色譜條件：Hypersil GOLD C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）;流速0.2 mL/min;柱溫40 ℃;進樣量10 ?L;流動相A：體積分數0.1%甲酸-水溶液，流動相B：體積分數0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脫程序：0.0～0.2 min，97%～90%流動相A;0.2～16.0 min，90%～60%流動相A;16.0～17.0 min，60%～20%流動相A;17.0～17.5 min，20%流動相A;17.5～18.5 min，20%～97%流動相A;18.5～25.0 min，97%流動相A。

質譜條件：噴霧電壓3 500 V;鞘氣流速38 arb;輔助氣流速15 arb;離子傳輸管溫度275 ℃;離子源霧化溫度380 ℃;碰撞氣壓力0.199 5 Pa（1.5 mTorr）;Q1和Q3分辨率均為0.7。

利用TraceFinder軟件進行數據處理，對各個樣品進行多重反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式掃描，通過比對各個物種的離子對信息，如保留時間、離子比率等，進行物種鑒別。為確保方法的準確性，每個物種選擇3 條特異性多肽，每條多肽選擇3 個子離子進行判定。該方法的離子對信息如表1所示。

2 結果與分析

2.1 PCR方法測定肉串源性成分的分析過程

對于豬、牛、羊源性成分的檢測，主要采用熒光定量PCR法，根據樣品測定的循環閾（cycle threshold，Ct）值進行結果判定。由標準SN/T 2051—2008可知，在進行實時熒光定量PCR檢測時，需設定陽性、陰性及空白對照。當滿足質控標準時，才可進行樣品結果判定。具體質控標準為：陰性對照：有HEX熒光信號檢出，并出現典型擴增曲線，Ct值應小于28.0，無FAM熒光信號檢出;陽性對照：有FAM和HEX熒光信號檢出，并出現典型擴增曲線，Ct值應小于28.0。具體判定標準為：如果同時進行的陰性、陽性對照實驗結果正常，檢測樣品時，不論HEX熒光信號是否檢出，如果有FAM熒光信號檢出，且Ct值≤35，判定為含有牛、豬、羊源性成分;如果Ct值>35，判定為不含有牛、豬、羊源性成分。部分實際樣品檢測結果見圖1。

對于雞、鴨源性成分檢測，主要采用PCR法，根據樣品凝膠電泳條帶及PCR產物測序情況進行結果判定。由標準SN/T 2978—2011可知，在陽性對照組出現131 bp的條帶，陰性對照組無該條帶出現、空白對照組無條帶出現時，視為該實驗成立。在實驗成立前提下，樣品出現131 bp左右的擴增產物則判定為結果陽性，否則為陰性。將可疑陽性PCR擴增產物進行核酸系列測定，與GenBank中雞線粒體DNA相對應片段的序列進行比對，同源性達到98%以上，則含有雞源性成分。同理，標準SN/T 3731.5—2013規定，鴨源性成分對應條帶為226 bp。牛肉串樣品檢測結果見圖2，由電泳圖可知，樣品中只含有鴨源性成分。

鴨源陽性對照. 實驗體系中加入鴨源DNA;真實樣品1～2. 購買的牛肉串樣品;陰性對照. 實驗體系中加入非鴨源DNA（牛源DNA）;空白對照. 實驗體系中用去離子水替代DNA;實驗體系、加入的試劑、DNA及操作過程均與SN/T 3731.5—2013一致。

2.2 LC-MS/MS方法測定肉串源性成分的分析過程

MS檢測方法通過篩選各物種之間的差異蛋白質氨基酸序列，即各物種的相對特異性多肽鏈，轉化為離子對信息后，進而應用至LC-MS/MS中進行樣品檢測。其中篩選物種特異性多肽鏈是檢測的關鍵步驟，直接影響最終結果的準確性。

2.2.1 物種特異性多肽鏈的篩選

收集豬、牛、羊、雞、鴨純物種肉，經1.3.2.1節樣品制備后，進行高分辨質譜分析。本研究采用Thermo Q Exactive HF-X液相色譜四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜進行數據采集，其液相色譜條件與1.3.2.2節LC-MS/MS分析時所采用的條件相同，質譜條件采用Full MS-ddMS2掃描方式，噴霧電壓3 400 V，毛細管溫度320 ℃，鞘氣流速40 arb，輔助氣流速15 arb，Full Scan分辨率120 000，掃描質量范圍m/z 350～2 000，AGC值3×106，IT時間100 ms，二級掃描topN為10，分辨率30 000，AGC值2×105，IT時間50 ms，NCE設為30。

將質譜采集的數據導入至蛋白質組學處理軟件Proteome Discoverer（PD）軟件，通過該軟件尋找各物種之間的多肽差異。PD軟件處理數據有2 個工作流，分別為Processing step和Consensus step，2 個工作流中的參數均可按照默認參數進行設置。Processing step中需要上傳所要篩選物種的蛋白質數據庫，可通過搜索UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/），下載相應物種的蛋白質數據庫fasta文件，導入至PD軟件后，即可運行程序，得到各物種篩選的多肽數據。通過這種方式得到豬蛋白1 111 條、多肽2 437 條，牛蛋白1 173 條、多肽2 812 條，羊蛋白524 條、多肽2 150 條，雞蛋白566 條、多肽2 107 條，鴨蛋白578 條、多肽2 419 條。由于這5 個物種是研究比較成熟的物種，所以蛋白質數據庫信息比較完善、全面，由此所得到的物種蛋白信息比較繁雜，因此還需要對搜索參數進一步優化，從而能夠快速尋找物種多肽序列之間的差異。

在尋找物種間多肽差異的過程中，以下幾個因素對篩選結果有較明顯的影響：1）肽段長度，肽段越短，物種多肽匹配的錯誤率就越高，故設置多肽長度>7;2）置信度，與物種多肽確定的可靠性有關，將篩選物種設置為High，其他物種設置為Not Found;3）響應強度，質譜在進行數據采集時，易出現離子抑制效應，因此響應強度高的多肽受到的影響相對較小，多肽的響應強度設置為>107，并選擇響應強度最高的電荷下的母離子;4）覆蓋率，表示由多肽匹配至蛋白質時的準確度，覆蓋率越高，準確度越高，設置覆蓋率>50%。通過上述參數的設置可以明顯篩除90%的多肽序列，進一步簡化后續篩選過程。再將所得到的多肽進行Blast序列匹配，進一步確保多肽的物種唯一性。最終得到豬蛋白35 條、多肽64 條，牛蛋白19 條、多肽35 條，羊蛋白15 條、多肽21 條，雞蛋白18 條、多肽47 條，鴨蛋白17 條、多肽34 條。

2.2.2 篩選適用于LC-MS/MS分析的物種多肽標記物

高分辨質譜的分辨率較高，可精確測定至分子質量的小數點后4 位，能夠準確推斷分子的結構式，因此用高分辨質譜篩選物種特異性多肽。LC-MS/MS屬于低分辨率質譜，但儀器的MRM掃描模式可通過準確測定一級離子與二級離子同時判定化合物的存在，這大大降低了基質干擾的影響，定性、定量更為準確，因此LC-MS/MS的適用性更廣。在本研究中，將高分辨質譜所篩選的物種特異性多肽信息轉換為離子對信息，應用至LC-MS/MS中，創建更為準確、便捷的方法。

高分辨質譜采集數據時，采用的是Full MS-ddMS2掃描模式，因此可以通過查看多肽的二級譜圖，按照響應強度的大小選擇每個母離子下的多個二級子離子，轉化為相應的MRM信息，應用至LC-MS/MS中。但由于2 種質譜的分辨率、掃描速率、采集方式等參數存在差異，因此導入至LC-MS/MS中的多肽離子信息還需進一步篩選，通過對比每個子離子的峰形、保留時間、響應強度等參數，選擇適用于LC-MS/MS的多肽信息。為確保物種判定的準確性，每個物種選擇3 條特異性多肽，每條多肽保留3 個子離子信息進行判定。最終各物種所篩選的特異性多肽詳細信息如表2所示。圖3展示了部分實際樣品的提取離子流圖。

2.3 肉串測定結果及分析

分別采用PCR方法及LC-MS/MS方法對北京市場購置的200 個烤肉串樣品進行源性成分檢測，所得到的結果一致。由表3可知，共有42 個樣品存在樣品信息與測定結果不符的現象，摻假率為21%，其中羊肉串摻假28 例，占比28%，牛肉串摻假14 例，占比14%。其中26 例摻假樣品中的摻假物種為豬，15 例摻假物種為鴨，1 例牛肉串的摻假物種為羊，所使用的摻假物種與物種本身的形態、氣味、價格、易獲取程度均有關系。

2.4 LC-MS/MS方法的靈敏度

業內普遍共識認為，物種摻假量低于1%時，不屬于人為刻意摻假[32]。為確保該方法滿足此條件，進行物種摻假實驗設計。模擬樣品1：分別準確稱取0.1 g豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉及10 g羊肉，均質混勻;模擬樣品2：分別準確稱取0.1 g豬肉、羊肉、雞肉、鴨肉及10 g牛肉，均質混勻。經上述LC-MS/MS方法測定。由圖4可知，所有摻入物種均不受其他物種基質的影響，因此該方法適用于測定物種摻假量低于1%的食品。

3 討 論

基于靶標多肽進行物種真偽鑒別的方法是近年來的研究熱點，目前國內針對物種鑒定的標準所采用的方法絕大多數是PCR方法，僅在《中國藥典》（2015年版）鑒定阿膠真偽中增加了肽圖分析，采用高相液相色譜-質譜聯用檢測離子m/z 539.8，對阿膠進行定性鑒別[33]。

此外，分析總結國內外相關研究，該類方法均采用的是鳥槍法蛋白組學方法，整個實驗方法流程如圖5所示，純物種樣品經蛋白提取、酶解等處理過程，經高分辨質譜及相應軟件進行靶標多肽的篩選，轉換為相應的離子信息應用至LC-MS/MS中進行物種鑒別。在分析過程中，不同實驗室采用了不同方式進行最終物種鑒別。Montowska等[32]針對牛肉漢堡中添加的功能性粉末制劑進行鑒別，利用高分辨質譜對大豆、豌豆、牛乳及甜菜根中的靶標多肽進行篩選，并對市場中的熟牛肉漢堡進行檢測。相對而言，LC-MS/MS的抗基質干擾能力使其在定量方面可測出更低的源性成分，且普及度更高，因此采用LC-MS/MS方法進行物種鑒別更為方便，相關研究也較多。部分研究針對某一特定蛋白進行明確的多肽分析，Magdalena等[34]利用環境解吸電噴霧質譜和液相萃取表面分析質譜對原料肉中骨骼肌蛋白質進行鑒定分析，通過物種特異性多肽可以明確區分牛肉、馬肉、豬肉、雞肉和火雞肉。Giaretta等[35]以肌紅蛋白作為標記蛋白，利用超高效液相色譜技術區分牛、豬、雞、馬等多個物種，并且可以測定肉糜中質量分數5%的豬肉或牛肉。此外，關于源性成分的研究也擴展至其他的非肉物種鑒別，Hoffmann等[36]針對肉類食品中使用的植物蛋白羽扇豆、豌豆及大豆進行測定，每個物種篩選3～4 個標記物，建立相應的高效液相色譜-串聯質譜法，該方法的檢出限為豌豆蛋白約5 mg/kg、大豆蛋白約4 mg/kg、羽扇豆蛋白約2 mg/kg。Montowska等[37]利用液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜對肉制品中的大豆、牛乳及蛋清蛋白進行分析，分別選取43 個大豆多肽、9 個牛乳多肽及12 個蛋清多肽作為標記物，以鑒別禽肉產品中是否存在大豆、牛乳、蛋清等過敏性蛋白。

本研究利用鳥槍蛋白組學方法，首先通過高分辨質譜及相應的蛋白組學軟件篩選豬、牛、羊、雞、鴨5 個物種的特異性多肽信息，經相應的信息轉化及進一步篩選，最終建立可以準確測定物種源性成分質量分數低于1%的LC-MS/MS方法，并通過大量的市場樣本進行方法驗證，且同時采用目前成熟的PCR方法進行驗證比對，2 種方法所得到的結果一致，也進一步證明LC-MS/MS方法鑒別物種的準確性較高。從實驗操作方面考慮，在測定大批量實驗樣品時，相對于PCR方法，LC-MS/MS方法的實驗過程更為簡便，可通過一次性實驗操作測定多個物種，耗時更短，操作更為便捷，并且成本更低，可用于日常食品的摻假檢測。

4 結 論

分別通過PCR方法及LC-MS/MS方法對北京市場中的200 個肉串進行源性成分分析。其中PCR方法采用出入境標準進行測定，LC-MS/MS方法通過測定物種特異性多肽鏈信息進行物種鑒別。結果表明：2 種方法所得到的結果一致，肉串摻假比例為21%，其中羊肉串摻假比例為28%，牛肉串摻假比例為14%，摻假物種主要為豬、鴨。通過大批量樣品實驗對比，LC-MS/MS方法的準確性較高，且實驗操作更為簡便，方法更為省時、耗費更低，可用于日常食品檢測。

參考文獻：

[1] WANG Guiji， ZHOU Guangyun， REN Haowei， et al. Peptide biomarkers identified by LC-MS in processed meats of five animal species[J]. Journal of Food Composition and Analysis， 2018， 73：?47-54. DOI：10.1016/j.jfca.2018.07.004.

[2] STADER C， JUDAS M， JIRA W. A rapid UHPLC-MS/MS screening method for the detection of the addition of porcine blood plasma to emulsion-type pork sausages[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry， 2019， 411（25）： 1-13. DOI：10.1007/s00216-019-02043-2.

[3] 張靜嫻， 胡青， 董洪霜， 等. 超高效液相色譜-三重四極桿質譜法用于阿膠糕類食品中阿膠的鑒別及馬、牛、羊、豬皮源成分的檢測[J]. 世界中醫藥， 2019， 14（4）： 59-63. DOI：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.008.

[4] CHEN Q， KE Xing， ZHANG Jingshun， et al. Proteomics method to quantify the percentage of cow， goat， and sheep milks in raw materials for dairy products[J]. Journal of Dairy Science， 2016， 99： 9483-9492. DOI：10.3168/jds.2015-10739.

[5] 孟佳， 古淑青， 方真， 等. 高效液相色譜-串聯質譜法測定肉制品和調味料中7 種水產品過敏原[J]. 色譜， 2019， 37（7）： 712-722. DOI：10.3724/SP.J.1123.2019.01042.

[6] MARTINEZ-ESTESO M J， NORGAARD J， BROHEE M， et al. Label-free proteomic analysis of wheat gluten protein and their immunoreactivity to ELISA antibodies[J]. Cereal Chemistry， 2017， 94（5）： 820-826. DOI：10.1094/CCHEM-11-16-0266-R.

[7] ZVEREVA E A， KOVALEV L I， IVANOV A V， et al. Enzyme immunoassay and proteomic characterization of troponin I as a marker of mammalian muscle compounds in raw meat and some meat products[J]. Meat Science， 2015， 105： 46-52. DOI：10.1016/j.meatsci.2015.03.001.

[8] HSIEH Y H， SHEU S C， BRIDGMAN R C. Development of a monoclonal antibody specific to cooked mammalian meats[J]. Journal of Food Protection， 1998， 61（4）： 476-481. DOI：10.4315/0362-028x-61.4.476.

[9] CAI Yicun， HE Yuping， L? Rong， et al. Detection and quantification of beef and pork materials in meat products by duplex droplet digital PCR[J]. PLoS One， 2017， 12（8）： e0181949. DOI：10.1371/journal.pone.0181949.

[10] SHEHATA H R， LI J P， CHEN S， et al. Droplet digital polymerase chain reaction （ddPCR） assays integrated with an internal control for quantification of bovine， porcine， chicken and turkey species in food and feed[J]. PLoS One， 2017， 12（8）： e0182872. DOI：10.1371/journal.pone.0182872.

[11] 田晨曦， 周巍， 王爽， 等. 基于DNA條形碼技術常見肉類摻假鑒別技術的研究[J]. 現代食品科技， 2016， 32（8）： 295-301. DOI：10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.8.045.

[12] 鐘文濤， 王芳妹， 李白玉， 等. 四重PCR反應體系的建立及在牛肉摻假檢測中的應用[J]. 現代生物醫學進展， 2016， 16（18）： 3574-3577. DOI：10.13241/j.cnki.pmb.2016.18.045.

[13] MUSTO M， FARAONE D， CELLINI F， et al. Changes of DNA quality and meat physicochemical properties in bovine Supraspinatus muscle during microwave heating[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2014， 94（4）： 785-791. DOI：10.1002/jsfa.6441.

[14] ULCA P， BALTA H， ?AGIN ?， et al. Meat species identification and Halal authentication using PCR analysis of raw and cooked traditional Turkish foods[J]. Meat Science， 2013， 94（3）： 280-284. DOI：10.1016/j.meatsci.2013.03.008.

[15] BUCKLEY M. Species identification of bovine， ovine and porcine type 1 collagen; comparing peptide mass fingerprinting and LC-based proteomics methods[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2016， 17（4）： 445-461. DOI：10.3390/ijms17040445.

[16] 張穎穎， 趙文濤， 李慧晨， 等. 液相色譜串聯質譜對摻假牛肉的鑒別及定量研究[J]. 現代食品科技， 2017， 33（2）： 230-237. DOI：10.13982/j.mfst.1673-9078.2017.2.035.

[17] MARCHIS D， ALTOMARE A， GILI M， et al. LC-MS/MS identification of species-specific muscle peptides in processed animal proteins[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2017， 65（48）： 10638-10650. DOI：10.1021/acs.jafc.7b04639.

[18] SENTANDREU M A， FRASER P D， HALKET J， et al. A proteomic-based approach for detection of chicken in meat mixes[J]. Journal of Proteome Research， 2010， 9（7）： 3374-3383. DOI：10.1021/pr9008942.

[19] VON BARGEN C， DOJAHN J， WAIDELICH D， et al. New sensitive high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the detection of horse and pork in halal beef[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2013， 61（49）： 11986-11994. DOI：10.1021/jf404121b.

[20] KIM G D， SEO J K， YUM H W， et al. Protein markers for discrimination of meat species in raw beef， pork and poultry and their mixtures[J]. Food Chemistry， 2017， 217： 163-170. DOI：10.1016/j.foodchem.2016.08.100.

[21] 李瑩瑩， 張穎穎， 丁小軍， 等. 液相色譜-串聯質譜法對羊肉中鴨肉摻假的鑒別[J]. 食品科學， 2016， 37（6）： 204-209. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201606037.

[22] ORDUNA A R， HUSBY E， YANG C T， et al. Assessment of meat authenticity using bioinformatics， targeted peptide biomarkers and high-resolution mass spectrometry[J]. Food Additives and Contaminants， 2015， 32（10）： 1709-1717. DOI：10.1080/19440049.2015.1064173.

[23] MOTTA T M C， HOFF R B， BARRETO F， et al. Detection and confirmation of milk adulteration with cheese whey using proteomic-like sample preparation and liquid chromatography-electrospray-tandem mass spectrometry analysis[J]. Talanta， 2014， 120： 498-505. DOI：10.1016/j.talanta.2013.11.093.

[24] YANG C T， GHOSH D， BEAUSRY F. Detection of gelatin adulteration using bioinformatics， proteomics and high-resolution mass spectrometry[J]. Food Additives and Contaminants： Part A， 2018， 35（4）： 599-608. DOI：10.1080/19440049.2017.1416680.

[25] PRANDI B， LAMBERTINI F， FACCINI A， et al. Mass spectrometry quantification of beef and pork meat in highly processed food： application on Bolognese sauce[J]. Food Control， 2017， 74： 61-69. DOI：10.1016/j.foodcont.2016.11.032.

[26] MONTOWSKA M， ALEXANDER M R， TUCKER G A， et al. Authentication of processed meat products by peptidomic analysis using rapid ambient mass spectrometry[J]. Food Chemistry， 2015， 187： 297-304. DOI：10.1016/j.foodchem.2015.04.078.

[27] 中華人民共和國遼寧出入境檢驗檢疫局， 寶生物工程（大連）有限公司， 中國檢驗檢疫科學研究院. 食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法 實時PCR法： SN/T 2051—2008[S]. 北京： 中國標準出版社， 2008： 1-16.

[28] 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局. 動物源性產品中雞源成分PCR檢測方法： SN/T 2978—2011[S]. 北京： 中國標準出版社， 2011： 1-7.

[29] 中國檢驗檢疫科學研究院， 中華人民共和國深圳出入境檢驗檢疫局， 深圳市檢驗檢疫科學研究院. 食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第5部分： 鴨成分檢測 PCR法： SN/T 3731.5—2013[S]. 北京： 中國標準出版社， 2013： 1-7.

[30] LI Yingying， ZHANG Yingying， LI Huichen， et al. Simultaneous determination of heat stable peptides for eight animal and plant species in meat products using UPLC-MS/MS method[J]. Food Chemistry， 2018， 245： 125-131. DOI：10.1016/j.foodchem.2017.09.066.

[31] ZHANG Yingying， WANG Shouwei， MA Yanhong， et al. Identification and absolute quantification of animal blood products by peptide markers using an UPLC-MS/MS method[J]. European Food Research and Technology， 2020， 246： 581-589. DOI：10.1007/s00217-019-03421-x.

[32] MONTOWSKA M， FORNAL E. Label-free quantification of meat proteins for evaluation of species composition of processed meat products[J]. Food Chemistry， 2017， 237： 1092-1100. DOI：10.1016/j.foodchem.2017.06.059.

[33] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[M]. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2015： 189.

[34] MAGDALENA M， RAO W， ALEXANDER M R， et al. Tryptic digestion coupled with ambient desorption electrospray ionization and liquid extraction surface analysis mass spectrometry enabling identification of skeletal muscle proteins in mixtures and distinguishing between beef， pork， horse， chicken， and turkey meat[J]. Analytical Chemistry， 2014， 86（9）： 4479-4487. DOI：10.1021.ac5003432.

[35] GIARETTA N， DI GIUSEPPE A M A， LIPPERT M， et al. Myoglobin as marker in meat adulteration： a UPLC method for determining the presence of pork meat in raw beef burger[J]. Food Chemistry， 2013， 141（3）： 1814-1820. DOI：10.1016/j.foodchem.2013.04.124.

[36] HOFFMANN B， MUNCH S， SCHWGELE F， et al. A sensitive HPLC-MS/MS screening method for the simultaneous detection of lupine， pea， and soy proteins in meat products[J]. Food Control， 2017， 71： 200-209. DOI：10.1016/j.foodcont.2016.06.021.

[37] MONTOWSKA M， FORNAL E. Detection of peptide markers of soy， milk and egg white allergenic proteins in poultry products by?LC-Q-TOF-MS/MS[J]. LWT-Food Science and Technology， 2018， 87：?310-317. DOI：10.1016/j.lwt.2017.08.091.