八味秦皮丸指紋圖譜及質(zhì)量可控性研究

海馨月 黃小清 覃媛媛 李 嬌 戴熒博 韓泳平

西南民族大學藥學院，四川 成都 610041

藏醫(yī)藥是祖國醫(yī)學寶庫中的瑰寶，但因歷史局限性，傳統(tǒng)藏藥還存在劑型不太合理、質(zhì)量標準水平較低、安全性和有效性難以保障等問題[1]。八味秦皮丸由秦皮、針鐵礦、草莓、多刺綠絨蒿、寒水石(制)、美麗風毛菊、朱砂、麝香等組成，為藏藥常用處方，具有接骨、消炎、止痛的功效，用于骨折、骨髓炎[2-3]。其現(xiàn)行質(zhì)量標準中僅有理化和薄層鑒別，缺乏指標性成分的定量測定，難以有效地綜合評價其內(nèi)在質(zhì)量。秦皮為本方中主藥，現(xiàn)代研究證明，秦皮中的主要有效成分秦皮甲素和秦皮乙素，具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用[4-7]。麝香對非特異性炎癥亦具有顯著抗炎效果。

實驗采用高效液相色譜法對該復方制劑多個廠家、多個批次樣品的指紋圖譜進行分析，為該制劑科學合理的質(zhì)量控制標準的建立提供了一定的依據(jù)[8-12]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Essentia LC-16型高效液相色譜儀；SPD-16高效液相紫外-可見檢測器； METTLER TOLEDO AE240電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 八味秦皮丸(0.25 g每丸，西藏甘露藏藥股份有限公司，產(chǎn)品批號：12214A、12220A、12226A、12238A、12247A、12255A、12265A、12277A、12280A、12287A、12293A、12298A)，甲醇為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 HPLC色譜條件 色譜柱：Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動相：甲醇-水溶液，以表1中梯度洗脫條件洗脫；體積流量：1.0 mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：254 nm。

表1 梯度洗脫表

2.1.2 供試品溶液的制備 取樣品精密稱量1.25 g，研勻成細粉，置于50 mL圓底燒瓶中，精密量取并加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量并記錄，于水浴上加熱回流30 min，冷水浸泡放冷，稱定質(zhì)量并記錄，用純甲醇補足減失的質(zhì)量，充分搖勻，抽濾，取上層續(xù)濾液再次進行精密過濾，得淡黃色溶液作為HPLC測定樣品溶液[7]。

2.2 八味秦皮丸指紋圖譜的建立 取12批八味秦皮丸樣品，按“1.2”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行進樣分析，得到八味秦皮丸的指紋圖譜(如圖1所示)，并采用國家藥典委員會開發(fā)的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A 版軟件對12 批樣品的指紋圖譜進行分析，以S5號樣品的圖譜為對照指紋圖譜(如圖2所示)，采用平均數(shù)相關(guān)系數(shù)法對各指紋圖譜色譜峰進行了多點校正和自動匹配，其中共有色譜峰25個，以出峰穩(wěn)定，峰面積較大的6號色譜峰為參照峰，然后進行了相似度計算，12批八味秦皮丸指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0. 95(表2)[8-9]。

圖1 八味秦皮丸的指紋圖譜

表2 相似度評價結(jié)果

續(xù)表2

圖2 對照圖譜

圖3 樣品聚類分析圖

2.3 八味秦皮丸指紋圖譜聚類分析 以12批樣品的25個明顯的共有色譜峰面積為指標，運用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件，進行聚類分析[10]。采用Ward法，平方Euclidean距離度量標準進行聚類分析，聚類結(jié)果如圖3所示。可以看出，12批樣品可以分為2類: S1、S2、S3、S5 號樣品為一類，剩余8批樣品為一類。原因可能是八味秦皮丸原料年份不同導致的差異。

2.4 八味秦皮丸指紋圖譜主成分分析(PCA) 應用 SPSS 統(tǒng)計分析軟件對12批八味秦皮丸進行了PCA[11]，即將它們投影至低維空間來看它們之間的微細差別，先將原始數(shù)據(jù)矩陣經(jīng)標準化處理，再對其進行運算。由表3看出，當特征值>1時，共提取到6個主成分。

表3 特征值與貢獻率

通過 SPSS 統(tǒng)計分析軟件計算出主成分矩陣，見表4。從表中可以看出14、20、23號色譜峰在主成分1中有明顯的負相關(guān)趨勢，表明其增加，第一主成分減少；8、9、10、12、13、16、22號色譜峰在第一主成分中有明顯的正相關(guān)趨勢，表明其增加，第一主成分增加，其他的色譜峰對第一主成分影響相對較小。6、15號色譜峰在主成分2中有明顯的負相關(guān)趨勢，表明其增加，第二主成分減少；4、11、20號色譜峰在主成分2中有明顯的正相關(guān)趨勢，表明其增加，第二主成分增加，其他的色譜峰對第二主成分影響相對較小。5、18、21、23號色譜峰在主成分3中有明顯的正相關(guān)趨勢，表明其增加，第三主成分增加；14、24、25號色譜峰有明顯的負相關(guān)趨勢，表明其增加，第三主成分減少，其他的色譜峰對第三主成分影響相對較小。5號色譜峰在主成分4中有明顯的正相關(guān)趨勢，表明其增加，第四主成分增大；18號色譜峰在主成分4中有明顯的負相關(guān)趨勢，表明其增加，第四主成分減少，其他的色譜峰對第四主成分影響相對較小。4號色譜峰在主成分5中有明顯的正相關(guān)趨勢，表明其增加，第五主成分增大；15號色譜峰在主成分5中有明顯的負相關(guān)趨勢，表明其增加，第五主成分減少，其他的色譜峰對第五主成分影響相對較小。 6、14、18、24號色譜峰在主成分6中有明顯的正相關(guān)趨勢，表明其增加，第六主成分增大；25號色譜峰在主成分6中有明顯的負相關(guān)趨勢，表明其增加，第六主成分減少，其他的色譜峰對第六主成分影響相對較小。

表4 主成分矩陣

續(xù)表4

對主成分矩陣數(shù)據(jù)進行 PCA 后，以主成分1和主成分2建立坐標系即得所有樣本的 PCA 平面得分圖(如圖4所示)，樣本的內(nèi)在相互關(guān)系可較好地表現(xiàn)出來進而實現(xiàn)樣品之間的分類，從圖中可以看出八味秦皮丸分為兩類，其結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致[12]。

圖4 主成分平面得分圖

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 本實驗曾按照文獻[4]，選用甲醇-水體系為流動相，檢測波長為344 nm，但在此條件下出峰太少不利于指紋圖譜研究；檢測波長為254 nm時出峰較多，有利于開展指紋圖譜研究。

3.2 梯度的選擇 取同一供試品試液，分別考察色譜峰的分離效果。在多個梯度洗脫條件中，發(fā)現(xiàn)只有在表1梯度洗脫條件下，樣品圖譜基線較平穩(wěn)，色譜峰峰形良好，各峰之間分離度較好。因此選擇表1中的梯度條件進行洗脫。

3.3 柱溫的選擇 取同一供試品溶液，在不同的色譜柱溫度下(18 ℃、室溫、30 ℃)，考察溫度對色譜峰分離情況的影響。結(jié)果表明，溫度對各峰的分離效果影響不大，考慮到采用室溫較簡便，因此最終確定測定用柱溫為室溫。

4 結(jié)論

通過指紋圖譜相似度評價軟件建立了12批八味秦皮丸指紋圖譜的共有模式，確認了25個共有峰，不同樣品之間的相似度均大于0.909，表明不同批次八味秦皮丸的質(zhì)量的一致性良好。聚類分析和PCA結(jié)果顯示，12個批次樣品可分為2類，這可能與藥品的儲存條件和時間相關(guān)。HPLC指紋圖譜法評價八味秦皮丸質(zhì)量的方法通過了方法學驗證，實驗結(jié)果表明，方法準確、簡便、重現(xiàn)性良好，能夠為本品的質(zhì)量控制提供方法學基礎(chǔ)。