HPLC法測定咳喘停袋泡顆粒中丹參酮ⅡA的含量

孔凡建 寸待秋

1.云南省玉溪市食品藥品檢驗所，云南 玉溪 653100；2.云南師范大學(xué)，云南 昆明 650500

咳喘停袋泡顆粒是玉溪市中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)純中藥制劑[批準(zhǔn)文號：滇藥制字(Z)20082202F號，規(guī)格：6 g×6袋]，由金銀花、丹參、羅漢果等藥組成，具有清熱化痰、宣肺止咳的功效，用于痰熱型急慢性支氣管炎。丹參為方中君藥，其活性成分主要包括脂溶性成分和水溶性成分[1]，丹參酮ⅡA是脂溶性成分的代表之一，相對含量較高，有擴(kuò)張冠脈、抗心肌缺血、阻礙和誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的增長和凋亡等作用[2-3]。目前，該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為滇ZJGF-101-2018，該標(biāo)準(zhǔn)中收載有性狀、鑒別、檢查項目，其中對丹參中有效成分的質(zhì)量控制，僅鑒別項下有薄層色譜法對丹參酮ⅡA進(jìn)行定性鑒別，但對丹參酮ⅡA的含量測定并未收載具體方法，不利于質(zhì)量控制。為提高該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究以丹參酮ⅡA為咳喘停袋泡顆粒的含量指標(biāo)，建立HPLC法測定咳喘停袋泡顆粒中丹參酮ⅡA的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)、BP211D-OCE和MSEI24S-11CE-DV型號的電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、CPX5800H-C超聲波清洗機(jī)(必能信超市上海有限公司)、Carry60紫外分光光度計(安捷倫科技-中國有限公司)。

1.2 試藥 咳喘停袋泡顆粒(玉溪市中醫(yī)醫(yī)院制劑室配制，批號：20171218，20181214，20190214)；丹參酮ⅡA對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110766-201721，國家藥品標(biāo)準(zhǔn)檢驗用，含量以99.5%計)；色譜純甲醇(德國默克公司)，純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測波長的選擇 取丹參酮ⅡA對照品適量，用甲醇配制成0.5 μg·mL-1丹參酮ⅡA對照品溶液，照紫外-可見分光光度法(《中國藥典》2015版四部)，在200～400 nm范圍下掃描，如圖1所示。結(jié)果顯示丹參酮ⅡA在270 nm波長處有最大吸收，參照文獻(xiàn)[4]及試驗結(jié)果，確定檢測波長為270 nm。

圖1 丹參酮ⅡA紫外吸收光譜

2.2 色譜條件 色譜柱為ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(70∶30)；流速：1.0 mL·min-1;檢測波長：270 nm;柱溫：35 ℃;進(jìn)樣量：20 μL。

2.3 溶液的配制

2.3.1 供試品溶液的制備 將適量的咳喘停袋泡顆粒倒于研缽中研細(xì)、混勻，取樣品3 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱重，超聲提取30 min，冷卻后用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取丹參酮ⅡA對照品12.58 mg，用甲醇溶解并定容到25 mL棕色容量瓶中，即得質(zhì)量濃度為0.5007 mg·mL-1的對照品儲備溶液，置于4℃以下的冰箱儲存、備用。精密量取2 mL對照品儲備液，用甲醇稀釋并定容到100 mL棕色容量瓶中，搖勻，得到對照品溶液。

2.3.3 陰性對照溶液 另取缺丹參的其他味藥按處方工藝制成陰性制劑，按“2.3.1”項下供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

2.4 專屬性試驗 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，如圖2所示。結(jié)果表明，供試品溶液的色譜圖在與對照品溶液的色譜圖相應(yīng)保留時間處顯相同的峰，陰性對照溶液在與對照品溶液相應(yīng)保留時間處未顯示色譜峰。

a:丹參酮ⅡA對照品；b:供試品；c：陰性對照圖2 HPLC圖

2.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.3.2”項下對照品儲備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得丹參酮ⅡA對照系列濃度溶液(2.5035、5.0070、10.0140、15.0210、20.0280、25.0350 μg·mL-1)，0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)樣20 μL，以峰面積值(A)為縱坐標(biāo)，含量(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：A=111605X-10425(r=0.9998，n=6)，結(jié)果表明，丹參酮ⅡA在2.5035～25.0350 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度測定 精密吸取“2.3.2”項下的對照品溶液20μL，注入色譜儀，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果丹參酮ⅡA峰面積的RSD為0.16%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗 取同一批樣品(批號：20190214)，按“2.3.1”項下供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，記錄峰面積并計算丹參酮ⅡA的含量平均值為0.1605 mg·g-1，RSD為0.52%(n=6)，結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.3.1”項下的供試品溶液，分別于0、1、3、6、9、12 h精密吸取20 μL進(jìn)樣，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果丹參酮ⅡA色譜峰面積的RSD為0.66%(n=6)，表明供試品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 檢出限 精密吸取“2.5”項下質(zhì)量濃度為2.5035 μg·mL-1的對照品溶液20 μL注入色譜圖，測定信噪比為50.8，以S/N=3計算檢出限為0.1478 μg·mL-1。

2.10 加樣回收率試驗 分別稱取9份研細(xì)混勻后的咳喘停袋泡顆粒1.5g(批號：20190214)，精密稱定。將9份樣品平均分成3組，分別加入質(zhì)量濃度為0.5007 mg·mL-1對照品溶液0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL后，按“2.3.1”項下供試品溶液制備方法處理，搖勻，過濾，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，計算丹參酮ⅡA的平均加樣回收率為101.11%，RSD為1.39%(n=9)，見表 1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.11 樣品的含量測定 將3個批次的樣品，分別于研缽中研細(xì)、混勻，各取樣品約3 g，精密稱定，按“2.3.1”項下供試品溶液制備方法處理，精密吸取20 μL樣品液注入液相色譜儀測定，記錄峰面積，根據(jù)“2.5”項下所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果 (mg·g-1)

3 討論

3.1 流動相的選擇 試驗分別以乙腈-0.2%乙酸梯度洗脫[5]、甲醇-水(80∶20)[6]、甲醇-水(70∶30)為流動相。結(jié)果以乙腈-0.2%乙酸梯度洗脫時，基線波動較大；以甲醇-水(80∶20)為流動相時，分離效果不佳，而以甲醇-水(70∶30)為流動相時，丹參酮ⅡA峰形較好，分離效果良好，故采用甲醇-水(70∶30)為流動相。

3.2 樣品處理方法 比較振搖和超聲處理樣品，結(jié)果超聲更有利于樣品中丹參酮ⅡA的提取[7]。試驗對比超聲時間的長短，發(fā)現(xiàn)20 min時樣品中測得丹參酮ⅡA含量偏低，30 與40 min時測得丹參酮ⅡA含量穩(wěn)定、無差異。綜合考慮，選擇樣品超聲30 min合適。

3.3 耐用性試驗 試驗采用Agilent1260和島津LC20AT液相色譜儀分別對同一樣品進(jìn)行分析，分別測得樣品的含量分別為0.1608 mg·g-1、0.1605 mg·g-1，結(jié)果差異較小。使用島津LC20AT液相色譜儀，考察不同品牌色譜柱的使用：安捷倫ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、島津Wondasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、漢邦Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，結(jié)果丹參酮ⅡA在3種色譜柱的保留時間分別為:41.12 min、37.86 min和34.32 min，分離度分別為4.5、3.9和3.5，分離度均大于1.5，結(jié)果表明不同品牌的色譜柱均能滿足檢測的需求。