大豆滯綠(stay-green)突變體誘變后代生理指標及品質分析

鄭 赟 尹藝臻 溫宏偉,2 王 鵬 李貴全*

(1.山西農業大學 農學院，山西 太谷 030801； 2.山西農業大學 小麥研究所，山西 臨汾 041000)

在植物衰老過程中，會發生一系列生理生化變化導致葉綠素降解，發生黃化現象，進而使光合作用能力下降， 光合產物的形成量也隨之降低，生物量增加變得緩慢直至完全停止[1]。在植株生育末期葉片衰老過程中，會出現葉綠素不降解或降解不明顯的情況，葉片和果實仍然保持綠色及較強的光合作用，這種現象稱為滯綠(stay-green)[2]。大豆 [Glycinemax(Linn.) Merr.] 種質資源豐富，存在功能型和非功能型2種滯綠突變體。功能型滯綠突變體的葉片衰老機制受損，葉綠素降解和衰老速率減慢，保持綠色，可進行較長時間的光合作用和生物產量的積累，其生物產量及抗逆能力顯著高于野生型，這類突變體對提高作物產量具有重要的研究意義。陳駿伯[3]研究發現“持綠型”小麥的葉片具有高光合活性，使合成的同化物持續大量地運輸到籽粒中，從而提高產量。白紅丹等[4]研究‘科豐14’大豆滯綠突變系，發現突變體成熟后期莖葉和籽粒種皮色均呈現綠色，葉綠素降解較慢，因此大豆滯綠突變體具有提高產量的潛力。非功能型滯綠突變體僅僅是葉綠素降解受到抑制，光合作用仍然隨植物衰老而下降，因此是研究葉綠素降解的理想材料。

作為重要的油料、食用和飼料作物，大豆為全世界提供了30%的植物油脂及60%植物蛋白，其營養價值高，含量豐富[5]。大豆蛋白質是重要的植物蛋白，含量高達種子干重的35%～40%[6]，是谷類作物蛋白含量的3～5倍[7]，主要由球蛋白(59%～81%)和白蛋白(8%～25%)組成[8]。大豆蛋白質含有8種人體必需氨基酸，其中除蛋氨酸和半胱氨酸，其他氨基酸含量均達到了世界衛生組織推薦的標準[9]。大豆脂肪含量高達20%[10]，在人體內的營養和消化率極高，是一種重要的優質食用油[9]，主要成分為游離脂肪酸、芳香油、固醇、色素和有機酸脂類等，不含膽固醇[7]，不飽和脂肪酸含量達到了脂肪酸總量的60%左右，其中亞油酸含量占50%以上[11]。因此大豆具有預防高血壓、肥胖、糖尿病、骨質疏松和心腦血管疾病等功效[12-14]。

目前，由于作物本身特性及育種水平等因素的限制，我國大豆生產面臨著單產、品質水平均較低等嚴峻問題，嚴重影響市場競爭力，高產優質大豆的選育受制于生態環境復雜、種質資源匱乏和雜交育種方法單一等因素[5]。相關研究表明大豆產量與品質、蛋白質含量和脂肪含量間都存在一定程度上的負相關[15-16]，對雙高品種的創制提出了較大的挑戰。大豆滯綠突變體的發現為大豆育種提供了新的研究思路，其獨特的葉綠素不降解特性為選育兼顧雙高品質及高產大豆品種提供了更多的可能。滯綠大豆的品質性狀相關方面的研究鮮有報道。本研究以誘變得到的大豆滯綠突變體M6代為試材，按照種皮色和子葉色進行分類，對各類群體的光合速率、葉綠素含量、蛋白質含量和脂肪含量進行測定并統計分析，并發掘其中潛在的優質品系，旨在闡明滯綠突變體中葉綠素降解和大豆品質的關系以及不同類型大豆光合作用的差異，以期為選育特色大豆、高品質大豆提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為大豆滯綠突變體‘Z-94320’(田間自然突變雙青豆，來自山西農業大學大豆育種研究室)及其誘變獲得的突變體M6代分離群體，總計108個分離單系。滯綠突變體大豆，種皮色和子葉色均為綠色，褐臍，灰茸毛，紫花，尖葉型，亞有限結莢習性，一般有效分枝0～2個，百粒重20.34 g左右，生育期一般在115～120 d，蛋白質含量44.9 g/100 g，脂肪含量21.4 g/100 g。

1.2 試驗設計

2012年，在山西農業大學大豆遺傳育種試驗室中，利用劑量率為100 R/min的60Co-γ射線對滯綠突變體‘Z-94320’的干種子進行輻射誘變處理，獲得誘變新種質。

將誘變所得新種質種植于大田，進行連續5代目標性狀的自交定向分離篩選，于2017年5月13日在山西農業大學農學院大豆育種試驗田種植M5代誘變突變體種子，采收獲得108個M6代的誘變突變體分離單系。依次以1，2，…，108進行編號，將各單系繼續種植于大田，采用隨機區組設計，行長5 m，行距0.5 m，株距0.25 m，重復3次，田間管理采用常規技術。

1.3 測定項目和測定方法

1.3.1葉綠素含量(SPAD值)的測定

用SPAD-502葉綠素測定儀測定M6代群體的苗期、盛花期和衰老期的葉綠素含量，3次重復。測定時，隨機選取誘變后代各分離單系3株，選取頂部同一部位葉片測定，每個葉片隨機選取3個測量點，取其平均值。

選用葉綠素變化率來表示誘變后代材料的滯綠性，以此更好地說明大豆滯綠突變體后代中不同種皮色(綠、淺綠、黃)滯綠的程度和子葉色(綠、黃)類型在衰老過程中與葉片葉綠素降解的關系，本研究中葉綠素變化率=(衰老期葉綠素含量-盛花期葉綠素含量)/盛花期葉綠素含量×100%。

1.3.2光合參數的測定

大豆進入鼓粒期后，選光線好的晴天， 9：00—15：00用CI-340光合儀測定M6代各分離單系的光合參數，3次重復，光照強度為1 000 μmol/(m2·s)左右。

1.3.3品質性狀的測定

成熟后，將M6代植株上收獲的籽粒曬干，置于Infratec TM 1241 Grain Analyzer V5.00品質分析儀中，檢測籽粒中蛋白質和脂肪的含量，進行3次重復。

1.4 統計分析

用Microsoft Excel對統計記錄的數據進行整理，用SPSS 24.0和DPS 6.05軟件對數據進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 滯綠突變體后代分離系的葉綠素含量比較

滯綠大豆誘變后代群體中出現了豐富的變異(圖1和圖2)，根據種皮色和子葉色將其分為4種類型，分別命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，其中Ⅰ類種皮色綠色和子葉色綠色；Ⅱ類種皮色淺綠色和子葉綠色；Ⅲ類種皮色淺綠色和子葉色黃色；Ⅳ類種皮色黃色和子葉色黃色。

(a)豆莢顏色的變異；(b)莢粒數的變異；(c)同色豆莢中的不同顏色籽粒 (a) Variation of pod color; (b) Variation of pod number; (c) Different color seeds of the same color pods圖1 滯綠突變體后代豆莢的變異Fig.1 Variation of pods in the progenies of stay-green mutants

(a)種皮色變異；(b)籽粒顏色從綠變黃 (a) Variation of seed coat color; (b) Seed color changes from green to yellow圖2 滯綠突變體后代的籽粒變異Fig.2 Seed variation of progenies of stay-green mutants

由表1可知，衰老期的葉綠素SPAD值，Ⅰ、Ⅱ類群之間并無明顯差異，但是都顯著高于Ⅲ、Ⅳ類群，葉綠素變化率在4個類群之間表現出顯著差異(P<0.05)。Ⅰ類群葉綠素變化率的范圍在-28.57～31.20%，平均變化率為12.27%，其中僅有材料7、58、76和78出現衰老期葉綠素下降的情況；Ⅱ類群葉綠素變化率的范圍在-21.62～44.85%，平均變化率為10.85%，其中則出現了較Ⅰ類更多的葉綠素降低情況；Ⅲ類群體中衰老期葉片葉綠素SPAD值較前兩類略低，且除8、9、32、43、91號材料其他都表現為下降，平均變化率為-6.39%；Ⅳ類群體中衰老期葉片葉綠素SPAD平均值僅為19.23，該類群的所有材料都表現出正常的下降情況，平均變化率達到-47.42%。因此，將Ⅰ、Ⅱ類群劃分為滯綠型，Ⅲ、Ⅳ劃分為普通型。

表1 不同類群的衰老期葉片SPAD值及變化率Table 1 SPAD value during senescence and change rate of each group

2.2 滯綠突變體后代分離系的光合作用比較

由圖3可知，類群Ⅱ的凈光合速率較其他類群顯著低于Ⅳ類群，Ⅰ、Ⅲ類群與其他類群的差異并不顯著，說明子葉色或種皮色的變化對凈光合速率并無影響；Ⅳ類群的蒸騰速率顯著高于Ⅰ、Ⅲ類群，Ⅱ類群則與其他類群無顯著差異，說明子葉色或種皮色的變化可能對蒸騰速率也并無影響；Ⅳ類群的氣孔導度顯著高于其他3個類群，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類群間無顯著差異，說明種皮色的變化可能會對氣孔導度產生影響；4個類群的細胞間CO2濃度并無差異，說明子葉色或種皮色的變化對胞間CO2濃度沒有影響。綜合光合作用指標發現除種皮滯綠會造成氣孔導度的降低外，子葉滯綠或種皮滯綠對光合作用并未產生明顯影響。

小寫字母表示差異顯著(P<0.05). Lower-case letters indicate significant differences (P<0.05).圖3 各類群光合參數比較分析Fig.3 Comparison analysis of photosynthetic parameters of each group

2.3 滯綠突變體后代分離系的品質性狀比較

從表2可知，滯綠型后代Ⅰ和Ⅱ類群之間的品質并無顯著差異，滯綠型后代的蛋白質含量與普通型后代的差異極顯著，脂肪含量則與Ⅲ類群存在顯著差異，與Ⅳ類群存在極顯著差異。

由圖4可知，在蛋白質含量方面，各類群由大到小分別為：Ⅱ>Ⅰ>Ⅲ>Ⅳ，滯綠型類群明顯高于普通型類群，其中Ⅰ類群的84號株系總蛋白質含量最高，達到46.5 g/100 g，Ⅳ類群的105號株系含量最低為40.9 g/100 g。在大豆的脂肪含量方面，各類群由大到小分別為：Ⅱ>Ⅲ>Ⅰ>Ⅳ,其中Ⅲ類群的91號株系脂肪含量最高，達到22.1 g/100 g，Ⅳ類群的105號株系含量最低為20.6 g/100 g，滯綠型類群雖然高于普通型，但是Ⅲ類群高于Ⅰ類群的情況也不能忽略，這可能是由于蛋白質含量和脂肪含量存在負相關性的影響，過高的蛋白質積累抑制了脂肪含量的增長。通過與對照株系(CK)的蛋白質含量和脂肪含量相比較，各M6代株系的變化有增有減，但是各類群的蛋白質含量平均水平則表現為全部降低，脂肪含量除類群Ⅳ降低其他三類均為增高。綜合來看，滯綠性狀對改善大豆品質有顯著的影響，蛋白質和脂肪含量同時增加是存在可能的。

表2 各類群品質的的差異顯著性分析Table 2 Analysis on the difference of quality of each group

(a)蛋白質含量的變化；(b)脂肪含量的變化 (a) Changes in protein content; (b) Changes in fat content圖4 各類群的品質變化趨勢Fig.4 Quality change trend of various groups

滯綠突變體生育期葉綠素的變化會影響到植物自身有機物的積累，因此葉綠素變化率和蛋白質、脂肪含量存在一定關系。由表3可知，在滯綠突變體后代中，葉綠素變化率、蛋白質含量、脂肪含量均與衰老期葉綠素含量存在著極顯著的正相關(P<0.01)，蛋白質含量和脂肪含量均與葉綠素變化率存在著極顯著的正相關(P<0.01)，說明葉綠素含量的增長會極顯著促進蛋白質含量和脂肪含量的增加。滯綠型大豆則可以使葉綠素含量長期維持在較高水平，從而使蛋白質和脂肪含量均顯著提高，由此推斷，滯綠大豆可以作為培育雙高(高蛋白高脂)大豆品種的種質材料。

3 討 論

近幾年對滯綠突變體的鑒定和有關基因的克隆加快了對葉片葉綠素降解的研究，高等植物葉片葉綠素降解的脫鎂葉綠酸氧化酶(Pheide a oxygenase，PaO)途徑已經闡明[17]。本研究中根據種皮色和子葉色將大豆滯綠突變體后代材料進行分類，主要側重于從形態和生理水平上觀察比較大豆滯綠和誘變后非滯綠大豆的差異及變化規律。通過研究4種類型誘變后代大豆的生育期葉綠素SPAD值的變化情況及葉綠素在衰老期降解幅度大小，發現種皮色和子葉色與葉片衰老期葉綠素降解程度存在著很大的關系。在大豆子葉色一致的情況下，種皮色越綠葉片葉綠素含量的變化率越大，滯綠性越強，反之則滯綠性較弱；種皮色一致(均為淺綠色)的情況下，在大豆衰老期，子葉色為綠色的突變系比黃色的突變系葉片葉綠素含量高，葉綠素降解幅度大，滯綠性強。因此按照種皮和子葉都滯綠與僅種皮滯綠可以劃分為2種大豆種子的滯綠基本類型[18]。Spano等[19]研究發現硬粒小麥功能性滯綠突變家系‘139’、‘142’、‘196’和‘504’相對于野生型，葉片葉綠素降解速率減緩，本研究中滯綠大豆相對于黃色大豆葉片葉綠素降解程度與Spano等[19]的研究結果一致。Christopher等[20]研究證實，滯綠小麥品種‘Seri M82’在灌漿期綠葉面積持續時間較長，葉綠素降解緩慢。植物滯綠突變體葉綠素降解機理已在分子基因水平上得以研究[2]，本研究的結果在生理水平上驗證滯綠突變體葉綠素降解的變化情況。

表3 蛋白含量、脂肪含量與葉綠素的相關性Table 3 Correlation between protein content, fat content and chlorophyll

滯綠大豆在逆境脅迫或衰老的情況下，由于自身葉綠素無法降解，可以延長抗逆或者衰老的時間，保證正常的光合作用進行，以此提高產量或品質。黃瑞冬[21]在對干旱脅迫下滯綠作物的生理狀況研究時發現，滯綠作物的葉片除葉綠素降解慢還保持著較強的光合作用。陳駿伯[3]發現持綠小麥在灌漿后期葉片中的活性氧清除系統可以持續高效地清除活性氧(ROS)和H2O2，從而使其在衰老時期依舊能夠維持較高的光合速率，使同化物大量積累，從而使產量增加。本研究由于試驗條件的限制和材料數量較多，只測定大豆鼓粒期的光合指標。作為決定豆科作物產量高低的關鍵時期[22]，鼓粒期會進行大豆生育期各階段最多的籽粒干物質積累，且干物質積累的狀況直接影響后期大豆產量的形成[23]。按照種皮和子葉色劃分的類群歸類整理統計，對各類群大豆鼓粒期的光合指標情況進行測定分析。結果發現，無論子葉或者種皮顏色如何，光合作用的強度并未由此造成直觀的改變，但綜合品質指標的情況發現，滯綠突變體類群的品質指標均優于黃色種皮黃色子葉的類群，這說明滯綠突變體類群的光合作用比普通大豆突變體類群持續更久，會產生更多的有機物積累，以此達到高產優質的特性。

60Co-γ誘變育種的重要目的是改善大豆品質[24]。H?rtensteiner[25]研究表明，光系統反應中心的葉綠素結合蛋白對氮源的高效再利用在植株的生長發育過程中起到重要作用。本研究中發現，無論滯綠與否，大豆葉片中葉綠素的含量與大豆蛋白質含量呈極顯著正相關關系(P<0.01)，與H?rtensteiner[25]研究結果一致。任鈞等[20]在已有研究基礎上推測大豆發育與成熟階段需要從衰老的葉片中導入大量的氮素, 因此滯綠性狀雖然可以影響衰老葉片中蛋白降解與轉運，但是對產量和品質性狀的改良是不利的，本研究中類群Ⅰ的滯綠性狀與類群Ⅱ相比更加明顯，若按照滯綠性狀可以使植物進行更多有機物積累的推測，類群Ⅰ的蛋白質含量應該顯著高于類群Ⅱ，但是實際結果恰恰相反，印證了任鈞等[20]的推測。王玫等[26]的研究中發現蛋白質含量的穩定性與產量、脂肪含量呈較強的負相關；李志剛等[27]在對大豆籽粒中干物質、脂肪和蛋白質積累規律的研究中發現，在大豆籽粒形成前期，蛋白質積累量與脂肪積累量呈顯著正相關，但從中期開始，脂肪積累量便隨著蛋白質積累量增加開始出現減少的情況。因此籽粒形成過程中蛋白質和脂肪含量同時增高的情況并不常見，而本研究中的蛋白質含量、脂肪含量與葉綠素含量變化率均呈現顯著的正相關，雖然脂肪含量的增長狀況并未表現十分明顯，其中存在的機理也有待進一步試驗探討。