應用于ＰＣＲ性別鑒定的朱鹮糞便基因組提取方法的建立

張漫慧　趙泓淙　王彩霞　王小雨　侯佳　張軍風　徐光嵐

摘要：使用無損傷采樣的方法收集朱鹮（Nipponin nippon）的糞便樣品，結合硫氰酸胍-硅珠法（GuSCN-SiO2）研究出了一種朱鹮糞便基因組提取的試劑配方和操作程序。結果表明，可應用于PCR性別鑒定的朱鹮糞便基因組提取方法的提取效率為85.11%。這種穩定有效的朱鹮糞便基因組提取試劑與提取方法可以有效解決目前朱鹮性別鑒定的困難，保證朱鹮人工種群在繁殖季節合理配對。

關鍵詞：朱鹮（Nipponin nippon）;鳥類繁殖;性別鑒定;糞便基因組

中圖分類號：S814.1 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：1007-273X（2020）08-0005-03

朱鹮（Nipponin nippon）是鸛形目（Ciconiifomes）鹮科（Threskiorothidae）的國家Ⅰ級保護野生動物。朱鹮曾遍布亞州東部和北部地區，由于人類過度獵殺和棲息地的喪失，朱鹮種群數量銳減以至被認為在野外滅絕[1]。

有效的朱鹮性別鑒定方法在朱鹮繁育過程中可避免錯配誤配的發生。目前朱鹮性別鑒定方法包括以下幾種：根據外觀和行為來判斷，但準確率較低[2];腹腔鏡檢的準確性相對較高，但操作過程對鳥類傷害較大，易導致不育甚至死亡;類固醇激素法易受到各種因素的影響，個體差異性、樣品新鮮度均會導致鑒定結果不準確。此外，染色體核型分析也是常用的一種性別鑒定方法，但朱鹮大小染色體的辨別與數量統計十分復雜，操作過程繁瑣，不適用于實踐推廣[3]。

近年來興起的分子生物學方法具有準確性高、靈敏度高的優點。鳥類分子生物學的鑒定位點包括ATP5A1基因、EE0.6序列、染色體螺旋蛋白基因（Chromobox-helicase-DNA binding gene，CHD-1）。鳥類的CHD-1位于性染色體上，高度保守，CHD基因有兩個同源拷貝CHD-W和CHD-Z，其中CHD-W為W連鎖，CHD-Z為Z連鎖，可通過特異性引物對Z染色體和W染色體上的同源特異序列進行PCR擴增[4，5]。有研究表明，CHD-1被應用于多種單態性鳥類的性別鑒定[6，7]。付晶等[8]曾通過特異引物2550F/2718R對CHD-1進行特異性擴增來鑒定鵪鶉（Coturnix coturnix）性別。針對朱鹮性別鑒定的引物2550F/2517R對于CHD-1的擴增效果良好，出現非特異性擴增條帶[8]。He等[9]使用引物2550F/2517R進行朱鹮血液基因組的PCR反應并將目的條帶進行純化與回收，根據測序后的序列對2550F/2517R進行優化，設計新引物2467F/2530R，在朱鹮性別鑒定的PCR擴增中避免了非特異性條帶的出現。

前期研究一般將血液樣品作為朱鹮性別鑒定的生物學材料來源，但采樣過程繁瑣，對朱鹮有直接損害，在實踐中不宜作為常規方法進行大批量實施和推廣。鳥類的遺傳學研究需要采取樣品，而非損傷取樣以及對采樣動物干擾小的優勢被普遍應用于珍稀鳥類的研究。糞便是無損傷取樣中常用的樣品采集對象，采樣過程中與動物基本無接觸，因此動物很少產生應激，適合種群數量小且應激較大的鳥類研究取樣[10-12]。目前關于珍稀鳥類糞便基因組提取的方法在雷鳥（Tetrao urogallus urogallus）、大鴇（Otis tarda）中有所提及，但不同鳥類的食性與消化系統有所差異，對其方法通用性產生了制約，而市場上的試劑盒較為昂貴且無針對性。因此，建立一種朱鹮糞便基因組提取并用其進行PCR性別鑒定的方法顯得十分迫切。

1 ?材料與方法

1.1 ?樣品來源

本研究在陜西省珍稀野生動物搶救飼養研究中心采集51份朱鹮糞便樣品。使用5 mL糞便采集管采集49份已知性別朱鹮糞便樣品（雌鳥25份，雄鳥24份），分別加入3 mL無水乙醇混勻，-20 ℃保存備用;使用2 mL注射器翅下靜脈取1份雌性朱鹮血液樣品與1份雄性朱鹮血液樣品。樣品采集詳細信息見表1。

1.2 ?主要試劑

Quick Taq HS Dye Mix（貨號：DTM-101，100次反應） 購自日本東洋紡公司;SDS購自德國Biofroxx公司;蛋白酶K購自索萊寶公司;異硫氰酸胍購自上海源葉生物公司;聚乙烯吡咯烷酮購自上海藍季生物公司;無水乙醇與碘化鉀均購自西隴科學公司;BIOG糞便DNA提取試劑盒（貨號51031，50次反應）購自常州百代生物公司;血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（貨號DP304-02，50次反應）與通用型DNA純化回收試劑盒（貨號DP214-02，50次反應）均購自天根生化科技公司。

1.3 ?試驗方法

使用試劑盒提取不同性別朱鹮血液基因組DNA，使用朱鹮性別鑒定特異性引物（2467F：5'-CGTCAGTTTCCCTTTCAG-3';2530R：5'-CCAGTGCTTGTTTCCTCA-3'）進行聚合酶鏈式反應PCR擴增。PCR擴增反應條件為94 ℃預變性2 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸8 min;30個循環。

研究使用改良硫氰酸胍-硅珠法提取糞便基因組DNA，確定試劑的組成，優化操作程序。使用試劑盒與改良硫氰酸胍-硅珠法提取朱鹮糞便基因組，進行PCR擴增并對產物進行膠回收純化測序，對本研究建立的改良硫氰酸胍-硅珠法糞便基因組提取質量與效率進行探究。

1.4 ?改良硫氰酸胍-硅珠法糞便基因組提取法的建立

1.4.1 ?改良硫氰酸胍-硅珠法相關試劑配制組分

（1）SiO2磁珠懸液。取5 g SiO2固體溶于50 mL去離子水，充分混勻后室溫靜置12 h，棄上清，加入5 mL濃度為8 mol/L的KI溶液，充分混勻后室溫靜置6 h，4 ℃避光保存。

（2）裂解液。終濃度為50 mmol/L的Tris-HCl（pH 8.0）、200 mmol/L的NaCl、200 mmol/L的EDTA （pH 8.0）、200 mmol/L的Proteinase K、1% SDS。

（3）提取液。終濃度為100 mmol/L的Tris-HCl（pH 6.4）、5 mol/L的GuSCN、200 mmol/L的EDTA （pH 8.0）、1.3%的TritonX-100。

（4）洗滌液A。終濃度為100 mmol/L的Tris-HCl（pH 6.4）、5 mol/L的GuSCN、200 mmol/L的EDTA （pH 8.0）

（5）洗滌液B。終濃度為100 mmol/L的Tris-HCl（pH7.5）溶液、1 mmol/L的EDTA（pH 8.0）溶液、5 mol/L的NaCl溶液、55%乙醇。

1.4.2 ?改良硫氰酸胍-硅珠法提取步驟的設計

（1）取朱鹮糞便懸液500 μL于2 mL離心管中，12 000 r/m離心2 min棄上清液，加入1 mL PBS振蕩重懸沉淀，重復此步驟至上清無色，加入1 mL PBS浸泡1.5 h。

（2）12 000 r/m離心10 min棄上清液，加入1 mL裂解液，充分振蕩混勻后放入37 ℃恒溫振動培養箱過夜（12～16 h）。

（3）12 000 r/m離心10 min，取600 μL上清液轉移到新的離心管中，加入800 μL提取液，37 ℃搖動培養10 min。

（4）將上述溶液700 μL轉移到吸附柱中，12 000 r/m離心2 min棄上清液，再將剩余的700 μL溶液轉移到吸附柱中，12 000 r/m離心2 min棄上清液。

（5）向柱中加入200 μL SiO2磁珠懸液室溫靜置20 min。

（6）12 000 r/m離心1 min后棄上清液，向吸附柱內加入500 μL的洗滌液A，12 000 r/m離心2 min棄上清液。重復一次。

（7）向吸附柱內加入500 μL洗滌液B，12 000 r/m離心2 min棄上清液。重復一次。將吸附柱室溫開蓋放置5 min，徹底晾干洗滌液。

（8）取出離心柱放入新的1.5 mL離心管，向離心柱吸附膜懸空滴加60 μL去離子水，55 ℃放置5 min，12 000 r/m離心1 min收集DNA溶液。

（9）將上一步收集的DNA溶液重新滴加到吸附膜，55 ℃放置5 min。12 000 r/m離心2 min，收集DNA溶液。置于-20 ℃冰箱。

2 ?結果與分析

2.1 ?朱鹮性別鑒定引物2467F/2530R的驗證

將朱鹮血液總基因組DNA作為模板，2467F/2530R為引物按照上述反應體系與反應程序進行普通PCR擴增，雄性朱鹮出現一條552 bp的條帶，雌性朱鹮出現353 bp與552 bp的兩條帶，與預期結果一致（圖1）。

2.2 ?改良硫氰酸胍-硅珠法與試劑盒法提取糞便基因組進行性別鑒定的效果對比

將分別使用試劑盒與改良硫氰酸胍-硅珠法進行朱鹮糞便基因組總DNA提取的基因組樣本為模板、以雌性血液樣本基因組和雄性血液樣本基因組作為陽性對照進行普通PCR擴增，結果表明，改良硫氰酸胍-硅珠法與試劑盒法所得到的朱鹮糞便基因組均可以作為朱鹮性別鑒定的DNA模板（圖2）。

2.3 ?改良硫氰酸胍-硅珠法進行朱鹮性別鑒定的效果分析

采用改良硫氰酸胍-硅珠法從47份糞便樣品中提取朱鹮總基因組DNA。共得到40份濃度與純度處在正常范圍內的基因組模板（19份雌性糞便樣品，21份雄性糞便樣品），普通PCR擴增結果如圖3所示，可鑒定其性別。綜上，改良硫氰酸胍-硅珠法提取基因組DNA進行朱鹮性別的鑒定效率為85.11%。證明引物2467F/2530R可用于朱鹮性別鑒定，雄性朱鹮出現1條552 bp的條帶，雌性朱鹮出現353與552 bp兩條帶，建立的朱鹮糞便基因組改良硫氰酸胍-硅珠法驗證47份朱鹮糞便樣品，85.11%可用于PCR擴增的基因組模板。

3 ?討論

人工種群的維持和擴大是朱鹮保護工作中重要的一環。隨著分子生物學的快速發展，鳥類性別鑒定的通用引物也已經在朱鹮血液基因組上得到驗證并改進。無損傷取樣較傳統的取樣方法對動物應激小，對采樣對象幾乎無影響，尤其是糞便樣品的采集，對動物無接觸，優勢更加明顯，被廣泛應用于珍稀野生動物的研究[13，14]。糞便不止作為一種生物資源被人們有效利用，并且作為最安全的無損傷取樣材料，是朱鹮進行性別鑒定良好的基因組來源[15]。

有國外研究者使用硫氰酸胍-硅珠法在大鴇糞便中成功提取出基因組DNA，國內研究者用同樣的方法并未成功提取出白頭鶴糞便基因組DNA[16]，繼而對提取方法加以優化，成功進行了白頭鶴的性別鑒定。白頭鶴與朱鹮都屬涉禽，本研究在預試驗使用上述方法均未成功提取出朱鹮基因組，表明不同鳥類之間的糞便基因組提取方法差異很大，需要對硫氰酸胍-硅珠法進行改進，建立起朱鹮特有的糞便基因組提取方法。

在試驗探究的過程中，出現了很多問題，例如DNA濃度非常低甚至無法測出，可能是由于糞便中脫落的腸道上皮細胞數量過少，導致提取量過低。在接下來的試驗中加大了糞便量，DNA濃度有所上升，但仍然會有一部分糞便DNA由于濃度過低而無法測出，推測是由于提取液過少引起的提取效率低下所致。將提取液與上清液的比例從2∶3提高至4∶3，結果有所改善，只有極少數會出現沒有濃度的情況，但是A260/A230比值小于1。由于本試驗的基因組提取方法為硫氰酸胍-硅珠法，極有可能出現胍鹽污染，將洗滌液中的乙醇體積分數從55%升高至75%，重復一次樣品洗滌步驟，基本上都得到了較理想的結果。

對于改良硫氰酸胍-硅珠法無法提取基因組的樣品，后續使用試劑盒再次進行該糞便基因組的提取，也未提取出可用于性別鑒定的基因組DNA。這說明樣品的采集與保存可能存在問題，因此針對樣品的保存方法還值得進一步探究。常見的糞便保存方法主要有無水乙醇保存法、70%乙醇保存法、-80 ℃冷凍法、烘干法、冷凍干燥法和硅膠干燥法等。不少研究者對上述糞便保存方法進行了效果比較分析，得出的結論也不盡相同[17，18]。筆者結合相關報道，推測不同種類的動物有食性和消化系統的區別，糞便保存的方法可能也因物種而異[13-18]。本研究采用了無水乙醇保存法，未對不同糞便樣品保存方法進行分析比較，或許有更優于無水乙醇的樣品保存方法等待著進一步研究與驗證。

參考文獻：

[1] 丁長青，李 ?峰.朱鹮的保護與研究[J].動物學雜志，2005（6）：54-62.

[2] 慶保平.成年朱鹮性別的簡易鑒定[J].野生動物，2010，31（1）：36，38.

[3] 劉凌云，王寶貴，郭學聰，等.朱鹮的染色體性別鑒定及核型分析[J].北京師范大學學報（自然科學版），1992（4）：554-557.

[4] 李 ?明，丁長青，魏輔文，等.朱鹮性別相關基因及其性別鑒定[J].科學通報，2001（2）：129-131.

[5] KASUGA K，HIGASHI M，YAMADA T，et al. The W- and Z-linked EE0.6 sequences used for molecular sexing of captive Japanese crested ibis on Sado island[J].Anim Sci J，2012，83（1）：83-87.

[6] 蘇 ?倡，李顯達，邢曉瑩，等.五種基于CHD基因的性別鑒定方法對雀形目鳥類有效性的實驗評估[J].野生動物學報，2019， 40（3）：1-9.

[7] GRIFFITHS R，DOUBLE M C，ORR K，et al. A DNA test to sex most birds[J].Mol Ecol，1998，7（8）：1071-1075.

[8] 付 ?晶，孫洪霞，白秀娟.鵪鶉性別鑒定的分子標記方法[J].東北農業大學學報，2010，41（1）：77-80.

[9] HE X L，QING B P，HAN J L，et al. Improved molecular assay for sex identification of the endangered crested ibis （Nipponia nippon） based on the CHD1 gene and a sex-linked microsatellite locus[J].Zool Sci，2013，30（9）：742-747.

[10] 黃 ?斌.非損傷性取樣法在珍稀瀕危動物遺傳學研究中的應用[J].生物學通報，2010，45（7）：9-10.

[11] 陳 ?珉，張恩迪.野生動物分子水平研究中的取樣方法進展[J].四川動物，2003（1）：18-22.

[12] 于 ?穎，王宏燕，周東興.畜禽糞便的資源化利用[J].東北農業大學學報，2009，40（8）：140-144.

[13] 代艷麗，周立志.一種改進的方法提取白頭鶴糞便DNA[J].野生動物，2011，32（4）：203-207，223.

[14] 趙健元，李進華.對影響哺乳動物糞便DNA提取相關因素的探討[J].生物學雜志，2008（3）：5-8.

[15] 李 ?娜，李迪強，王秀磊，等.糞便不同保存方法對動物基因組DNA提取效果的影響[J].國際遺傳學雜志，2006（5）：341-345，367.

[16] 劉艷華，張明海.馬鹿糞便樣品保存方法對DNA提取質量的影響[J].東北林業大學學報，2006（2）：67-69.

[17] 劉艷華，張 ?明.野生動物糞便在瀕危物種遺傳結構研究中的應用[J].野生動物，2006（1）：46-49.

[18] 周蕓蕓，張 ?宇，楊萬吉，等.不同保存方法對川金絲猴糞便DNA提取效果的影響[J].現代生物醫學進展，2018，18（1）：43-47.

收稿日期：2020-06-10

基金項目：國家自然科學基金面上項目（31771301）;陜西省自然科學基礎研究計劃面上項目（2019JM-038）

作者簡介：張漫慧（1995-），女，安徽阜陽人，在讀博士研究生，研究方向為動物生殖，（電子信箱）862314341@qq.com。