精液質量分析系統與血球計數板法測定精子密度方法誤差來源分析

文│張小香 張士海（北京市昌平區畜牧水產技術推廣站）

朱寬峰（北京田園奧瑞生物科技有限公司）

精液質量分析系統測定精子密度方法：在固定顯微鏡放大倍數和攝像頭的情況下，攝像機的視野大小固定，以米尼圖分析系統為例，20倍物鏡下攝像頭視野大小為563微米×563微米。此時采用厚度為20微米的精子計數板，則視野中精液體積為（0.563×0.563×0.02）毫米3＝6.34×10-6（毫升），計數多個全視野精子數求平均值x，則可計算出檢測樣品精子密度＝0.158x×106/毫升，再乘以稀釋倍數則可計算出原始樣品精子密度。

血球計數板法：計數5個面積為0.2毫米×0.2毫米，厚度為0.1毫米（中方格尺寸）區域的精子數x，然后可計算出精子密度＝x/（0.2×0.2×0.1×5）＝5x×104，再乘以稀釋倍數即得到原始樣品精子密度（圖1）。

綜上所述，以上兩種方法的物理原理一樣，都是通過固定計數范圍和特定厚度計數室來規定抽樣樣品的體積，然后對規定范圍內的精子進行計數，根據計數結果計算出單位體積的精子數，即精子密度。

這兩種方法主要的不同之處在于，血球計數板法一般是由人工計數，而精液質量分析系統是由計算機計數。受限于人工計數能力，5個中方格精子數超過200就很難數了，這就要求更大的稀釋倍數，并且只能檢測不動的精子。而計算機計數一個視野幾百個很正常，幾個視野下來累計計數1000個以上很容易，并且能和精子活力同時檢測，并且不用高倍稀釋。計數數量小和高倍稀釋會導致血球計數板法抽樣誤差更大，計算機檢測相反。根據不重復抽樣誤差公式，從一支牛凍精約0.25億總精子數中計數200個精子的抽樣誤差為u血＝Sx×［（1-200/2.5億）/200］0.5＝0.071Sx，而計數1000個的抽樣誤差為u機＝Sx×［（1-1000/2.5億）/1000］0.5＝0.032Sx，其中Sx表示樣本標準差。可見計算機計數的抽樣誤差僅為血球計數板法的1/4～1/2。

◎圖1 血球計數板計數室示意圖

人工計數準確性更高，計算機計數要低一些，文獻和實際經驗顯示，計算機識別準確率可達95%以上。

血球計數板法計數是在事先劃好線的方格內，精液質量分析系統的計數范圍是整個攝像頭視野。由于邊緣精子會導致精子無法被計算機識別，存在邊緣精子識別誤差。以米尼圖分析系統為例，按精子一半落在視野外就不被識別計算，豬精子的頭部長度為8微米，一半即為4微米，邊緣區面積占視野總面積比例為（563×4×4-4×4×4）/5632=2.82%，精子落在此范圍內的概率即為2.82%，即邊緣精子識別導致的誤差為2.82%。由于精子取向不同，上述情況只是誤差最大的情形，因此是最大誤差。最小誤差情形是精子一半寬度在邊緣外，豬精子寬約4微米此時誤差為（563×2×2-2×2×4）/5632＝0.71%。即邊緣誤差在0.71%～2.82%，平均為1.76%。實際誤差和精子與視野相對大小有關，精子越小，視野越大則邊緣誤差越小。

血球計數板計數室厚度為100微米，加工誤差為1微米的情況下由厚度導致的誤差為1%，而20微米的計數板則為5%，10微米的計數板則達到了10%。因此，在相同誤差要求的情況下，計數室厚度越小，對加工精度要求越高，一次性的精子計數板均難以達到1微米的精度，據筆者經驗，有的標稱20微米的計數板實際可能只有16微米，誤差達到20%。

由以上分析可知，血球計數板法主要的誤差來自抽樣誤差，而精液質量分析系統的誤差主要來自計數板加工精度和精子識別準確率。