逐水巴布貼質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究*

★ 歐陽煒 張誠光 朱雅玲（廣東省第二中醫(yī)院 廣州 510095）

惡性胸水惡性腫瘤引起的胸腔積液，患者的生存質(zhì)量差，西醫(yī)常用治療方法都屬于有創(chuàng)治療，易復(fù)發(fā)還會(huì)帶來各種并發(fā)癥，對(duì)于晚期腫瘤患者并不適用［1］。逐水膏為廣東省第二中醫(yī)院專家的臨床驗(yàn)方，從惡性胸腔積液病機(jī)出發(fā)，依據(jù)中醫(yī)學(xué)“內(nèi)病外治”理論研治的中藥外用制劑。以十棗湯為基礎(chǔ)方去大棗，結(jié)合甘草反甘遂、大戟、芫花的相反理論，加甘草、水蛭而成。功效峻下逐水、破血攻毒，將其貼敷于具有行氣利水之穴位，以疏導(dǎo)調(diào)理經(jīng)絡(luò)氣血，暢利水道，主要用于治療惡性胸腔積液。臨床實(shí)踐表明，可明顯減少胸水量，改善患者咳嗽、咳血、胸悶、胸痛、氣促癥狀，提高生活質(zhì)量，未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)。外用制劑患者多能耐受，使用方便［2-4］。我院欲將逐水巴布帖申報(bào)醫(yī)院制劑，本試驗(yàn)采用薄層鑒別法（TLC）對(duì)甘遂、芫花和甘草3味藥材進(jìn)行定性鑒別，對(duì)測定巴布貼中芫花素含量采用HPLC定量測定，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent1200型高效液相色譜儀，數(shù)顯恒溫水浴鍋（金控市科技儀器有限公司），KQ5200DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：700W，頻率：40kHz），Bp211D電子分析天平（德國），DHG-9070A型恒溫干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），硅膠G薄層板（10cm×10cm，青島海洋化工有限公司）。

1.2 試藥 逐水巴布貼（廣東省第二中醫(yī)院自制），所用藥材（芫花、甘遂、水蛭、甘草、大戟）均由廣東和翔制藥有限公司購得，經(jīng)鑒定符合《中國藥典》2015版一部有關(guān)規(guī)定；芫花素對(duì)照品（批號(hào)：111899-201202）、芫花對(duì)照藥材（批號(hào)：121062-201904）、甘遂對(duì)照藥材（批號(hào)：121042-201605）、甘草對(duì)照藥材（批號(hào)：120904-201620）均購于中國藥品生物制品檢定所；液相色譜流動(dòng)相中的甲醇為色譜純，其余均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

2.1.1 芫花 ①供試品溶液：取逐水巴布貼l片，剪碎后加甲醇25 mL，超聲10 min，濾液蒸干，加乙醇2 mL使殘?jiān)芙?。②?duì)照藥材溶液：取芫花對(duì)照藥材l g同法制得。③對(duì)照品溶液：取芫花素對(duì)照品2.15 mg，加甲醇制成每1.08 mg·mL-1對(duì)照品溶液。④陰性樣品溶液：按逐水巴布貼工藝制得缺芫花的巴布貼膏體，取膏體5 g，按照供試品溶液制備的方法制得陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液8 μL，對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上。以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶4∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

圖1 芫花的薄層色譜圖

2.1.2 甘遂 ①供試品溶液：取逐水巴布貼l片， 剪碎，加乙醇25 mL， 超聲30 min，濾液蒸干，加乙醇2 mL使殘?jiān)芙?。②?duì)照藥材溶液：取甘遂對(duì)照藥材l g，同法制得。③陰性樣品溶液：按逐水巴布貼工藝制得缺芫花的巴布貼膏體，取膏體5 g，按照供試品溶液制備的方法制得陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液8 μL，甘遂對(duì)照藥材溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-丙酮（5∶1）為展開劑， 展開， 取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液， 在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色淸晰。置紫外光燈（365 nm）下檢視。

圖2 甘遂的薄層色譜圖

2.1.3 甘草 ①供試品溶液：取逐水巴布貼l片，剪碎，加甲醇50 mL， 加熱回流1 h，濾液蒸干，加水40 mL使殘?jiān)芙?，加正丁?0 mL萃取，重復(fù)3遍，合并正丁醇萃取液， 用蒸餾水洗滌3次， 棄去水層，正丁醇層蒸干，加甲醇5 mL使殘?jiān)芙?，得供試品溶液。②?duì)照藥材溶液：取甘草對(duì)照藥材l g用100 mL水煮30 min，濾液濃縮至約30 mL，加正丁醇萃取，取正丁醇層蒸干，加甲醇5 mL使殘?jiān)芙狻＂坳幮詷悠啡芤海喊粗鹚筒假N工藝制得缺芫花的巴布貼膏體，取膏體5 g，按照供試品溶液制備的方法制得陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液8 μL，芫花對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液各各2 μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰乙酸-水（15∶1∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干， 噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色淸晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

圖3 甘草的薄層色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇-水-0.2%冰乙酸水溶液為流動(dòng)相（65∶35∶0.8），檢測波長235 nm；柱溫30℃；流速 0.8 mL·min-1。

2.2.2 溶液的制備 ①對(duì)照品溶液：取芫花素對(duì)照品5.33 mg，加甲醇25 mL配成含芫花素213.2 μg·mL-1的對(duì)照品母液。將母液稀釋至每1 mL含芫花素5、10、20、40、80 μg的對(duì)照品溶液。②供試品溶液：取逐水巴布貼，除去背襯，剪碎，取0.8 g，再精密加入甲醇5 mL，超聲提取60 min，靜置，用甲醇定容至刻度．濾過，取續(xù)濾液，即得。③陰性樣品溶液：處方中除去芫花藥材，按逐水巴布貼工藝制得缺芫花的巴布貼膏體，按照供試品溶液制備的方法制得陰性對(duì)照溶液。

2.2.3 專屬性考察 吸取上述對(duì)照品、供試品及陰性對(duì)照溶液各10 μL進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，供試品、對(duì)照品中芫花素相應(yīng)的保留時(shí)間無其他峰干擾，選擇性良好，陰性無干擾。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 母液稀釋至系列濃度對(duì)照品溶液，精密吸取各濃度對(duì)照品溶液2 μL進(jìn)樣，測定峰面積，得回歸方程：芫花素Y=85.459X-29.396（r=0.9997）。結(jié)果顯示，芫花素在5.33～85.25 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取42.64 μg·mL-1芫花素對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果芫花素峰面積RSD為0.39%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，于配制后0，2，4，8，10，12 h進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果芫花素峰面積RSD為0.85%（n=6），表明供試品溶液在制備后12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取逐水巴布貼6片，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液方法制備，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算含量。結(jié)果芫花素RSD為1.52%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取逐水巴布貼樣品6份，每份約0.5g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，精密加入21.32、42.64、85.28 μg·mL-1三個(gè)濃度的芫花素對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果表明，芫花素平均回收率為99.69%，RSD為1.30%（n=6）。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3 樣品測定 取逐水巴布貼樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果3批樣品含芫花素分別為：92.4786、91.5531、92.1022μg·g-1，平均含量為 0.09204 mg·g-1。

表2 芫花素含量測定結(jié)果

3 討論

在TLC檢驗(yàn)時(shí)，甘草薄層鑒別按照藥典需使用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板，查閱文獻(xiàn)亦有直接用硅膠G板做鑒別的報(bào)道［5］，嘗試后發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)清晰無拖尾。同時(shí)摸索了紅大戟的薄層鑒別，但沒有明顯斑點(diǎn)，紅大戟中主要有效成分為蒽醌類化合物，難溶于水，指標(biāo)成分經(jīng)提取后有所損失，導(dǎo)致含量過低，無法鑒別［6］。最終選取甘遂、芫花、甘草作為薄層鑒別指標(biāo)。

在含量測定時(shí)，處方中水蛭為君藥，本應(yīng)作為含量測定的指標(biāo)成分，但因?yàn)樗魏繙y定的指標(biāo)為抗凝血酶活性單位，但操作較復(fù)雜，不適合院內(nèi)制劑批量生產(chǎn)檢驗(yàn)［7-8］。其余藥味中除甘草外，甘遂、芫花、紅大戟均為有毒藥材。甘遂具有治療水腫，瀉胸腹水的功效，指標(biāo)成分大戟二烯醇屬于三萜類化合物，分子量大，難溶于水［9］。蕪花具有瀉水逐飲，治療水腫脹滿的功效，指標(biāo)成分芫花素屬于黃酮類化合物［10］。紅大戟屬于3-羥基巴戟醌和蘆西定屬于蒽醌類化合物，在TLC檢驗(yàn)時(shí)已無法鑒別。綜合考慮，選擇芫花素作為含量測定指標(biāo)。

綜上所述，本研究中甘遂、芫花、甘草的薄層鑒別和芫花素含量測定方法簡便穩(wěn)定，易于實(shí)現(xiàn)，可作為逐水巴布帖的質(zhì)量控制指標(biāo)。