河北省治療前人群HIV-1耐藥毒株分子傳播網絡研究

劉 萌，邢 輝，張玉琪，李 巖，王瑩瑩，安 寧，路新利

高效抗逆轉錄病毒治療(Highly active anti-retrovirus therapy, HARRT)可以有效抑制HIV病毒的復制，從而降低HIV感染者/艾滋病患者體內病毒載量，使機體免疫能力得到恢復或部分恢復，因此HARRT可以作為預防HIV病毒傳播的有效手段[1]，但隨著發現即治政策的實施，HARRT范圍進一步擴大，HIV-1耐藥基因突變已成為治療效果下降的主要原因[2]。因此加強對抗病毒治療前人群的HIV-1耐藥監測，可以為阻斷HIV-1耐藥株的傳播提供早期預警，并對監控HIV-1耐藥毒株傳播規律具有重要社會意義。本研究對河北省2018年上半年抗病毒治療前人群開展了HIV-1耐藥毒株流行情況橫斷面調查，為本省預防HIV-1耐藥毒株傳播及建立有效耐藥預警機制提供參考依據。

1 資料與方法

1.1研究對象 河北省轄區內2018年1月至6月新診斷報告的HIV-1感染者。入組標準為：年齡≥18歲、均未參加抗病毒治療、本省籍、已提供知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1樣本采集 使用EDTA抗凝采血管采集研究對象的外周靜脈血10 mL，24 h內離心分離血漿，-70 ℃保存備用。同時，收集包括人口學信息、感染途徑等流行病學信息。

1.2.2目的基因片段擴增 采用QIAsymphony SP全自動核酸提取儀提取血漿HIV-1 RNA，通過In-house法擴增HIV-1pol區基因(1.3 kb)，對應國際標準參考株HXB2的位置為2253-3553b。第一輪RT-PCR外引物擴增以RNA為模板，使用F1a(5′-TGAARGAITGYACTGARAGRCAGGCTAAT-3′, HXB2:2057-2085)和RT-R1(5′- ATCCCTGCATAAATCTGACTTGC-3′， HXB2:3370-3348)引物，按照TaKaRa One Step RNA PCR Kit說明書要求配置反應體系和設置反應條件。第二輪PCR擴增以外引物擴增產物的1∶10稀釋液作為模板，以F2(5′-CTTTARCTTCCCTCARATCACTCT-3′, HXB2:2243-2266)和R2(5′-CTTCTGTATGTCATTGACAGTCC-3′, HXB2: 3326-3304)為引物，按照TaKaRaTaq說明書配制反應體系和設置反應條件。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，將擴增陽性產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

1.2.3序列分析 用Sequencher4.10.1軟件對原始反應序列進行校對和拼接，用BioEdit7.0軟件進行序列比對和整理。使用MEGA 6.0軟件構建N-J (Neighbor-joining)系統進化樹(bootstrap設定為1000，校驗值≥70%判定為同一亞型)；將目的基因序列提交斯坦福大學HIV耐藥數據庫(http://hivdb.stanford.edu)，根據2014版WHO耐藥監測方案[3]，選擇耐藥數據庫全部20種耐藥藥物進行耐藥基因型分析及耐藥水平判定；將比對好的序列導入Hyphy2.2.4，利用TN93模型計算所有序列兩兩之間的基因距離，通過觀測不同閾值下傳播網絡中的傳播簇總數和連接總數的變化來確定最適基因距離閾值，序列間基因距離小于閾值表示他們感染密切相關，在網絡內會連接在一起，利用Cytoscape3.6.1軟件構建HIV-1分子傳播網絡。

1.2.4統計學分析 利用SAS 9.2軟件進行多因素Logistic回歸分析，探討HIV-1耐藥相關影響因素。

2 結 果

2.1流行病學特征 在獲得目的基因序列的276例HIV-1感染者中，以18～49歲(84.4%，233/276)、男性(94.2%，260/276)、已婚(47.8%，132/276)、漢族(97.1%，268/276)、初高中及中專文化學歷(63.0%，174/276)，同性性傳播途徑(75.0%，207/276)為主；CRF01_AE是最主要基因型，占49.6%(137/276)，其次是CRF07_BC(29.7%，82/276)、B(9.8%，27/276)、URFs(4.3%，12/276)、CRF55_01B(2.9%，8/276)、CRF08_BC(1.1%，3/276)、CRF68_01B(1.1%，3/276)、CRF65_cpx(1.1%，3/276)和CRF80_0107(0.4%，1/276)。URFs重組模式包括URF_01B(2.9%，8/276)、URF_01C(0.3%，1/276)、未知(1.1%，3/276)。

2.2耐藥位點及耐藥程度分析 HIV-1耐藥率為6.16%(17/276)。其中，NRTI類耐藥率為0.36%(1/276)，出現耐藥的位點為L74I，對阿巴卡韋(ABC)中度耐藥、去羥基苷(DDI)高度耐藥；NNRTI類耐藥率為4.35%(12/276)，其中有5例攜帶耐藥位點K103R/V179D，導致依非韋倫(EFV)、奈韋拉平(NVP)中度耐藥，利匹韋林(RPV)低度耐藥；有2例研究對象對EFV、NVP產生高度耐藥；PI類耐藥率為1.09%(3/276)，耐藥突變為M16I/L，對奈非那韋(NFV)產生耐藥；NNRTI及PI類藥物的雙重耐藥率為0.36%(1/276)；HIV-1耐藥突變位點及其耐藥程度詳見表1。

表1 抗病毒治療前HIV-1耐藥突變分析Tab.1 HIV-1 drug resistance mutations before antiviral therapy

2.3耐藥影響因素分析 針對性別、民族、婚姻、感染途徑、年齡、文化程度、亞型6個變量進行耐藥多因素Logistic回歸分析(見表2)。 結果顯示年齡(P<0.05)和亞型(P<0.05)是HIV-1發生耐藥突變的顯著性影響因素。18～29歲處于性活躍期的青年耐藥發生率最高，達到8.16%，其次是50歲以上的老年人(6.98%)；作為河北省主要的3種流行毒株，CRF01_AE亞型耐藥率為8.03%(11/137)，CRF07_BC亞型耐藥率為2.44%(2/82)，B亞型耐藥率為3.70%(1/27)。而其他變量對耐藥突變的影響無統計學意義(P>0.05)。

2.4HIV-1分子傳播網絡 利用TN93模型計算276條pol基因序列基因距離，在0.5%～2.0%的基因距離間，1.5%基因距離閾值下，傳播簇分辨率高且分子網絡中能區別的傳播簇最多，在此閾值下，構建HIV-1分子網絡圖，共有95條序列入網，入網率為34.4%(95/276)，共鑒別出30個傳播簇，其中≥3個節點的傳播簇共有9個。CRF07_BC序列在網絡中構成比最高，包括9個傳播簇，其中1個傳播簇包含27個節點，是網絡內最大的傳播簇，傳播風險較高；CRF01_AE序列在網絡中共包含16個傳播簇，其中發現K103R/V179D耐藥突變毒株在滄州地區同性性行為人群構成的三節點傳播簇中傳播，造成對EFV/NVP中度耐藥，RPV低度耐藥；M46I耐藥突變毒株在張家口地區同性性行為人群構成的兩節點傳播簇中傳播； URF_01B序列在網絡中包括2個傳播簇(7例)，該傳播簇攜帶V106I潛在耐藥突變，在保定、滄州地區同性及異性性行為人群構成的五節點傳播簇中傳播，在石家莊地區同性性行為人群構成的二節點傳播簇中傳播；B亞型序列在網絡中形成1個三節點傳播簇，同樣攜帶V106I潛在耐藥突變位點。詳見圖1與表3。

圖1 抗病毒治療前HIV-1分子傳播網絡圖Fig.1 HIV-1 molecular transmission network before antiviral therapy

2.5URF_01B重組亞型鑒定 利用鄰接法構建N-J系統進化樹(圖2)，共檢出8例(2.90%) URF_01B重組亞型。8例URF_01B與石家莊地區2015年、2018年報道[6-7]的CRF01_AE/B重組亞型獨立聚集成簇，校驗值為100%，初步判定這8例URFs為CRF01_AE/B重組亞型，通過HIV Database在線RIP 3.0軟件對8例URFs的基因序列進行鑲嵌結構分析，確定其為CRF01_AE和B亞型重組體。

表2 抗病毒治療前HIV-1耐藥影響因素分析Tab.2 Factors influencing HIV-1 drug resistance before antiviral therapy

表3 抗病毒治療前HIV-1分子網絡中耐藥株情況Tab.3 Information of HIV-1 resistant strains circulating in the molecular network before antiviral therapy

Black dot(●) denotes HIV-1 URF_01B； Black triangle(▲) denotes reference sequences圖2 8例URF_01B重組毒株pol區序列Neighbor-Joining進化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis based on HIV-1 pol gene sequences from URF_01B strains

3 討 論

本研究結果顯示CRF01_AE、CRF07_BC和B亞型是目前河北省前3個主要HIV-1流行毒株，與河北省鄰近地區北京和天津市的HIV-1流行毒株流行形式基本一致[4-5]。8例URF_01B與石家莊地區2015年、2018年報道[6-7]的CRF01_AE/B重組亞型獨立聚集成簇，在1.5%基因距離閾值下，7例URF_01B序列入網，這7例感染者分布在河北省中部及南部地區的石家莊、保定、滄州的同性傳播及異性傳播人群中，表明該重組亞型已通過性傳播方式發生跨地區傳播，且傳播關系相對較近。而且，7例URF_01B患者均攜帶V106I潛在耐藥突變位點。

同時證明抗病毒治療前HIV-1耐藥突變發生率為6.16%，低于北京市[4]、河南省[8]等臨近省市，與全國耐藥數據平均水平基本持平[9]。其中有3例產生高度耐藥，10例產生中度耐藥，4例產生低度耐藥。NNRTI類耐藥率最高為4.35%，主要耐藥突變為K103R/V179D，對依非韋倫(EFV)、奈韋拉平(NVP)中度耐藥，對利匹韋林(RPV)低度耐藥；NRTI類耐藥率為0.36%，出現耐藥的位點為L74I，對阿巴卡韋(ABC)中度耐藥、去羥基苷(DDI)高度耐藥；PI類耐藥率為1.09%，耐藥突變為M16I/L，對奈非那韋(NFV)產生耐藥；NNRTI及PI類藥物的雙重耐藥率為0.36%，尚未發現三重耐藥HIV-1感染者。

CRF01_AE作為目前河北省最主要流行毒株，其在滄州地區同性性行為人群中存在K103R/V179D耐藥突變位點的三節點傳播簇傳播，張家口地區同性性行為人群中存在M46I耐藥突變位點兩節點傳播簇傳播，這兩簇傳播簇同樣存在較大的跨地域擴散傳播風險。雖然HIV-1耐藥突變在CRF07_BC(2.44%)亞型中的分布明顯低于CRF01_AE(8.03%)和B(3.70%)亞型，然而CRF07_BC序列構建的分子傳播網絡最多，傳播速度最快。在當前性傳播(特別是男男同性傳播)已成為河北省主要傳播途徑的背景下，處在性活躍期的18～29歲青年成為耐藥突變產生的影響因素，會加速耐藥毒株向外傳播。

綜上所述，河北省抗病毒治療前HIV-1耐藥毒株傳播風險較高，且有新型重組毒株URF_01B攜帶相關潛在耐藥突變位點成簇傳播。因此，加強HIV-1耐藥毒株分子傳播動態監測，實時實施精準治療和干預措施，對降低耐藥突變對抗病毒治療效果的影響，防止耐藥毒株傳播具有重要意義。

利益沖突：無