循環腫瘤細胞與泌尿系腫瘤關系的研究進展*

熊波波，張勁松，李寧，王海峰，左毅剛，王劍松

[昆明醫科大學第二附屬醫院(云南省泌尿外科研究所) 泌尿外科，云南 昆明 650101]

惡性腫瘤是全世界發病率和病死率最高的疾病之一[1]。雖然目前的診斷和治療使患者病死率降低，但癌癥轉移后仍然無法治愈，癌癥轉移患者的比例≥90%[2]。循環腫瘤細胞（circulating tumor cells, CTC）可能是癌癥轉移或復發的重要危險途徑。越來越多的數據顯示，血液里存在的CTC 與癌癥轉移和預后密切相關[3]。泌尿系腫瘤診斷基本以影像學檢測為準，微小病灶無法識別，因此，CTC 有望成為泌尿系腫瘤早期診斷、治療及預后預測等有價值的生物標志物。

1 CTC 生物學

CTC 是在1 例乳腺癌死亡患者的血液中被發現的一種類似癌癥細胞的細胞，當時認為CTC 可能來源于原發或轉移灶的乳腺癌細胞，并探索CTC 與癌癥轉移的關系[4]。盡管自CTC 已發現約150年，但在20 世紀90年代中期前，很少有研究關注CTC，當時因技術落后，研究一直無進展。隨著醫學、腫瘤學、生物學、材料科學及化學等多學科研究的發展和研究者的不斷努力，特別是在過去的10年，CTC 已成為研究領域熱點[5]。

在通過循環血液轉移到遠處部位期間，癌細胞需進行一系列的血管內移位-外滲-定植；一旦進入循環，CTC 必須經受循環的剪切和免疫壓力。為適應生存，CTC 需要通過一些保護機制來成功地并入新組織內[6]。一種廣泛使用的理論是CTC 必須經歷上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）才能侵入，這種表型轉變伴隨著分子變化，使上皮細胞變得更具有侵襲性、運動性，并且能夠播種遠距離位點。CTC 面臨的一些物理障礙可以通過EMT 來解決，例如EMT 細胞下調E-鈣黏蛋白，使其能夠從鄰近的上皮細胞分離，并上調基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）活性，其通過局部細胞外基質（extracellular matrixc, ECM）的導航而進入微血管系統[7]。具有間充質特征的CTC 能預測許多癌癥的不良結果，表明這種表型轉變在循環/遠處轉移中占有優勢[8]。

在癌癥患者血液中發現CTC 簇，其由2 ～50 個細胞組成，較循環中的單個細胞少。通過各種技術在幾種癌癥組織中檢測到更大的簇，也稱為腫瘤微栓子，并且循環中存在這些微栓子通常與肺癌和乳腺癌預后非常差相關[9]。簇中的細胞顯示細胞凋亡缺乏，這有助于避免其失巢凋亡；在外滲時，群集內的自分泌信號傳導可促進其對遠端器官新環境的快速適應[10]。CTC 簇還可能含有來自原發部位的正常細胞，例如基質細胞，這對種子和土壤假說具有重要意義，帶來自身的土壤應該只能增強種子在遠處發芽的能力。另外血小板還以多種方式維持血液中的CTC 簇[11]。

炎癥特別是慢性炎癥起促進CTC 轉移的作用，白細胞介素-37（Interleukin-37, IL-37）是抗炎因子，能抑制多個促炎因子的表達。B16F1 細胞可誘導體內的炎癥，用B16F1 接種肺癌的小鼠體內IL-37 表達導致B16F1 小鼠肺轉移下降，并伴有B16F1 誘導的炎癥抑制，說明炎癥是癌癥轉移所必需的，并且IL-37 可以通過抑制癌癥相關的炎癥反應來有效地抑制癌癥轉移[12]。

CTC 的富集與分離有利于其分子和功能特征的探索，為確定CTC 存在的全部信息，實驗室進行DNA、RNAji 蛋白分析[9]。使用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, FISH）和陣列比較基因組雜交技術來研究染色體重排或CTC基因拷貝數的變化，下一代DNA 測序可以研究CTC 中的全基因組突變譜、CTC 和轉移瘤之間的突變譜，不僅揭示轉移的驅動突變，而且發現CTC 特異性突變，這些CTC 特異性突變實際上也存在原發性腫瘤和轉移瘤的亞克隆中[6]。通過個性化的CTC 分析，可以復制來自原發或轉移部位的CTC 分子發育的進化，從而可以檢測不常見的耐藥克隆[7]。CTC 的生物學研究可以有助于癌癥管理，從癌癥或癌癥治療過程中分離CTC 獲得的信息可為患者提供個體化的治療方法，也是癌癥精準治療的思路之一。

2 CTC 的檢測

1959 最早報道過濾和沉淀檢測CTCs 的方法[13]，1964年報道二維微濾系統微觀過濾CTC 分離方法[14]，1998年報道的免疫磁性分離方法是最常用的檢測技術[15]，2004 報道的CellSearch 系統是美國食品藥品監督管理局（food and drug administration, FDA）批準上市、用于檢測CTC 的第一產品，其尚未被醫學界廣泛接受，其原因為[16]： ①CellSearch 系統（設備）相當昂貴；②每個樣品的檢測成本很高，因為需要抗體來捕獲血液中的CTC；③檢測過程需要復雜的濃縮步驟；④每個樣品的檢測時間長；⑤捕獲的CTC 純度非常低；⑥不能分離出CTC 用于表型鑒定和分子分析；⑦敏感性和特異性低。由于這些問題，CellSearch 可能在不久的將來過時[17]。迄今為止，已經開發40 多種用于CTC 檢測的技術[18]。

CTC 的檢測過程包括捕獲、富集、檢測及釋放4 個階段[19]： ①捕獲主要是指CTC 細胞表面表達的特異性生物標志物，例如EpCAM 和CD45 來捕獲細胞；②富集是指CTC 的分離，目前方法包括逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）、熒光顯微鏡、熒光Spectro photometery、光學顯微鏡、表面增強拉曼散射、流式細胞儀、正負濃縮技術、四氯化碳濃縮技術、三維微濾技術、慣性聚焦、直接成像及電化學方法；③檢測包括Pt@Ag 納米花（Pt@AgNFs）和AuNP/乙炔黑納米材料、微流體技術、量子點及金納米顆粒作為信號探針的檢測方法；④釋放富集的CTC 用于進一步表型鑒定和分子分析[18]。目前，CTC 檢測的理想方法是根據細胞大小進行分離和捕獲；另外就是通過體外培養來區分惡性和良性細胞[7]。

CTC 面臨的2 個主要挑戰： ①外周血中CTC 含量低。估計每1 ml 全血含有約1×109個無核紅細胞、1×107個有核血細胞及1×108個血小板，每7.5 ml 全血僅有1 ～10 個CTC，在如此龐大的血細胞中檢測CTC 是一項重大挑戰；②白細胞污染。CTC 與白細胞間的大小和生物特征重疊可能導致白細胞污染，從而降低純度[6]。為解決第1 個問題，目前可設計新結構或顆粒以同時捕獲CTC 以放大檢測信號，以及使微芯片能夠同時捕獲和檢測單個CTC 和CTC 簇。為解決白細胞污染問題，主要有無標簽和基于標簽的方法： 一種方法是基于細胞特征擴大CTC 的大小；另一種方法是基于親和力結合將CTCs 與某些顆粒組合來擴大尺寸[20]。

3 前列腺癌

前列腺癌是男性第2 常見的癌癥，并且是全球癌癥相關死亡的第5 大原因[21]。目前選擇最合適的前列腺癌治療方法是基于Glenaon 評分和血清前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen, PSA）的治療，PSA的低特異性眾所周知，其在良性前列腺增生、感染等多種情況下也會出現PSA 升高，對療效判定的準確性較低，不適合用于治療監測[22]。另外，主動監測的患者需要重復前列腺活檢以確定疾病進展，然而經直腸或經會陰途徑的前列腺活檢是一種侵入性手術，血尿、便血、急性尿潴留、尿路感染及菌血癥等并發癥多發[23]。因此，為選擇合適的主動監測指標，需要更精確和侵入性更小的監測前列腺癌生物標志物。最近的一項薈萃分析表明，CTC 陽性表明預后不良，CTC計數是抵抗性前列腺癌患者存活率的潛在獨立預后因素[24]。因此，使用CTC 早期檢測藥物對特定治療的反應，能有效避免復發。

目前，普遍認為CTC 在前列腺癌中具有早期腫瘤診斷、疾病復發及轉移擴散監測，以及生物腫瘤表征的運用前景，是代表前列腺癌的可靠實時生物標志物[25]。因此，CTC 可用作前列腺癌患者預后、預測及臨床管理的理想生物標志物。相關研究評估基線CTC水平的預后價值，在接受化學療法和雄激素受體信號抑制劑治療的患者，基線CTC 水平與轉移性患者的臨床結果存在關聯，治療后患者血液中的CTC 水平降低與較長的總生存期相關。通過觀察PSA 水平和影像學的改變[26-27]表明CTC 的變化早于PSA 的變化，體現CTC 監測前列腺癌療效的有效性和準確性。

升高的外周血液CTC 水平（≥5 個細胞/7.5 ml）在轉移性去勢抵抗性前列腺癌（metastatic castration resistant prostate cancer, mCRPC）中傳遞陰性預后。VOGELZANG 等[28]在MAINSAIL 實驗中評估208 例患者對CTC 計數（基線或治療后）、總生存期與多西紫杉醇治療后的反應有關聯，結果在87 例（42%）患者中基線CTC＜5 個細胞/7.5 ml 血液，在121 例（58%）患者中≥5 個細胞/7.5 ml，CTC 計數≥5 個細胞/7.5 ml 與較低的總生存期相關。3 個周期后，CTC 從＜5 個細胞/7.5 ml 增加到≥5 個細胞/7.5 ml，縮短總生存期。而CTC 從≥5 個細胞/7.5 ml 減少到＜5 個細胞/7.5ml 與最佳預后相關。

來自mCRPC 患者的CTC 中雄激素受體剪接變體-7（androgen receptor splice variant-7, AR-V7） 與對阿比特龍和恩雜魯胺的抗性相關，然而卡巴他賽可能對AR-V7陽性患者有效。ONSTENK 等[29]研究卡巴他賽對mCRPC 患者的藥效學影響，并使用CellSearch 系統計算CTC。29 例患者中16 例（55%）檢測到AR-V7，其中基線7.5 ml 血液中≥10 個CTC的患者占100%，發現CTC 中AR-V7 的存在與無進展生存期無關，所以對卡巴他賽的反應似乎與mCRPC患者CTCs 的AR-V7 狀態無關。因此卡巴他賽可能是AR-V7 陽性CTC 患者的有效治療選擇。

在一項Ⅲ期臨床研究中，mCRPC 患者用多西紫杉醇與來那度胺化療3 個周期后的CTC 水平升高，預測存活率較低[28]。SCHER 等[27]的Ⅲ期實驗報道，全血中乳酸脫氫酶水平和CTC 數量是醋酸阿比特龍和多西紫杉醇治療mCRPC 患者總生存期的預測因子，CTC ≥5 個細胞/7.5 ml 患者的2年生存率為2%，而CTC＜5 個細胞/7.5 ml 患者2年生存率為46%（CTC在12 周時計數）。LORENTE 等[30]研究表明，在初始計數CTC ≥5 個細胞/7.5 ml 治療后，CTC 計數下降30%與化療和阿比特龍治療后mCRPC 患者的總生存期相關。THALGOTT 等[31]提出，CTC 計數似乎是生存和治療反應的早期且更敏感的預測因子，并且可以為個體化治療策略提供補充信息。

一些研究表明，根治性前列腺切除術后CTC 與生化復發有關。在250 例前列腺癌高危患者的研究中，外周血中前列腺干細胞抗原（prostate stem cell antigen,PSCA）mRNA 的表達是根治性前列腺切除術后生化復發的重要預測指標[32]。JEFFERS 等[33]報道，外周血前列腺特異性膜抗原（prostate specific membrane antigen, PSMA）mRNA 是根治性前列腺切除術后生化復發的預測因子，檢測外周血中含有PSMA mRNA 細胞的方式是通過RT-PCR 檢測CTC。

總體而言，CTC 的計數和表征已顯示出對轉移性和晚期前列腺癌患者預后和預測的強大潛力；同時CTC 檢測和表征已顯示出監測癌癥治療和指導精確癌癥治療的優勢。然而CTC 分子譜需要進一步的研究和探索，需要更大型臨床實驗來證實其臨床效用。

4 膀胱癌

膀胱癌是世界上最常見的癌癥之一，分為非肌肉侵入性膀胱癌（non-muscle invasive carcinoma of bladder, NMIBC）和肌肉浸潤膀胱癌（muscle invasive carcinoma of bladder, MIBC）。NMIBC 經常復發并進展為MIBC，存活率降低且遠處轉移頻繁。通過膀胱鏡檢查和活體組織標本病理檢查診斷膀胱癌，這通常伴不良反應，因此迫切需要開發用于MIBC 和NMIBC 的初始檢測和監測的新型診斷方法。美國FDA 批準用于膀胱癌檢測的尿液監測是可行的，但是尿液測定的敏感性、特異性及準確性仍然不理想[2]。為尋求新的分子標志物和多種測定法，使用微創液體活檢來識別膀胱癌中的生物標志物效果佳。血液中基于CTC 的標志物在預后、預測及監測膀胱癌方面是有希望的潛在標志物[34]。

CTC 可作為NMIBC 患者危險分層的預后標志物，可預測復發和進展。BUSETTO 等[35]研究155 例經病理證實診斷為高風險NMIBC 的患者，進行CTC 評估后接受經尿道膀胱腫瘤切除術，101 例患者（A 組）用CellSearch 自動化系統分析，54 例患者（B 組）用CELLection Dynabeads 手動系統分析，結果隨訪28 個月，共65 例（41.9%）復發，27 例（17.4%）疾病進展，9 例（5.8%）淋巴結或骨轉移。筆者的CTC 分析中，A 組20 例（19.8%）陽性，B 組24 例（44.4%），發現CTC 與首次復發時間有相關性。筆者觀察到75% CTC陽性患者（A 組）和83% CTC 陽性患者（B 組）復發率、進展時間也與CTC 密切相關，A、B 組CTC 患者進展率分別為65%和29%。ZHANG 等[36]一項薈萃分析也提出，外周血中CTC 的存在是尿路上皮癌患者預后不良的獨立預測指標，其還可以用作確認癌癥診斷的非侵入性方法。

CTC 是根治性膀胱切除術（radical cystectomy,RC）治療尿路上皮癌患者預后的獨立危險因素，術后復發風險更高。SOAVE 等[37]的一項非隨機前瞻性研究中，226 例尿路上皮癌患者行RC 治療，術前獲得所有患者血液樣本，并使用CellSearch 系統分析CTC，50 例患者（27%）給予鉑類輔助化療，185 例患者可用于分析，其中41 例患者（22.2%）出現CTC，結果在31 個月的中位隨訪期間，CTC 的存在與無輔助化療給藥患者的疾病復發和總體死亡率相關。在接受輔助化療的患者中，有或無CTC 的患者比較無差異。在未化療患者的多變量分析中，CTC 的存在是疾病復發的獨立預測因子；同時另外有研究指出，CTC 決定RC 術后是否需要輔助化療，認為臨床非轉移性尿路上皮癌患者接受RC 治療時存在CTC 是不良預后的有力預測指標，可能對輔助化療決策和監測有用，但是目前證據有限，因此強烈建議將CTC 整合到未來的UCB 臨床實驗中[38]。

程序性死亡受體-1（programmed death-1, PD-1）和程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1,PD-L1）檢查點抑制劑在一部分晚期膀胱癌患者中具有 活 性。ANANTHARAMAN 等[39]從MIBC 和25 例轉移性膀胱癌患者中分離CTC 的PD-L1 蛋白，發現在MIBC 和轉移性膀胱癌患者中均可檢測到CTC，在mBCa 患者中，CK+和CK-的CTC 均有PD-L1 表達。該研究結果表明通過微創過程識別晚期膀胱癌患者CTCs 的PD-L1 表達，可能具有指導檢查點抑制劑免疫療法的潛力，

5 腎癌

EpCAM 是一種表達于腎癌CTC 的上皮細胞表面蛋白，作為特異性標志物，可用于檢測腎癌的CTC，但只有少數腎腫瘤表達EpCAM，故關于腎癌的CTC研究報道較少。然而，目前不斷探索其他的腎癌特異性標志物來替代EpCAM，以提高對腎癌CTC 的檢測[40]。見表1。研究發現，晚期腎癌患者的血CTC 水平升高，并且與更具攻擊性的表型相關[41]。循環腎癌細胞能夠預測當前和未來的轉移，還發現外周血中CTC 的水平與腎癌中的淋巴結轉移存在相關。除CTC波形蛋白表達狀態外，還發現外周血中CTC 的計數與腎癌進展相關[42]。BAI 等[43]對腎癌患者外周血進行CellSearch 系統和上皮腫瘤細胞大小的分離，以研究CTC 的臨床意義，發現腎癌患者中CTC 的存在與較高的臨床分期相關，表明CTC 的存在可能是腎癌患者的預后標志物。目前關于CTC 在腎癌預后及檢測方面研究較少，但通過以上的研究發現CTC 仍可以作為腎癌患者預后的有效標志物，但需更多的臨床研究分析。

6 CTC 作為預后和臨床管理的理想標志物

個性化癌癥醫學需要開發腫瘤特異性生物標志物以優化靶向療法的選擇，同時更好地評估對治療的反應。CTC 異質性作為生物標志物開發是一項令人期待的研究，相當于提供腫瘤的識別指紋。盡管CTC 在血液中稀有，但表型多樣性和異質性；同時獲得方式為無創簡單，讓CTC 可以作為泌尿系腫瘤診斷、預后及評估治療效果的理想生物標志物。為提高CTC 生物標志物的精準度，可結合蛋白質組學、基因組學及轉錄組學的不同分子表型，結合臨床相關信息，以指導基于個體患者疾病的分子特征的治療選擇。目前正在進行的臨床研究，前瞻性地闡明基于CTC 的分子標志物在預測患者反應和促進精準醫學時代方面的作用。然而，基于液體活檢的預測評估臨床效用仍然需要通過臨床試驗來解決。總之，CTC 分析可以提供關于腫瘤生物學的重要信息，有可能提高治療的質量和功效，最終目標是提高患者的生存率。見表1。

表1 泌尿系腫瘤相關CTC 相關生物標志物

7 總結與展望

隨著新的靶向和免疫療法的出現，癌癥治療的進展將繼續擴大，同時強調精確和個性化治療。伴隨微創的液體活檢技術的出現，可能取代傳統活體組織檢查或切除標本。CTC 提供獲得關于癌癥的重要分子和細胞信息，提供實時預后和預測信息，有可能指導治療決策。CTC 還具有基于細胞和功能的研究的獨特優勢，可以提供關于癌癥轉移過程的有價值的信息，包括CTC 的產生，他們在血液中的存活，以及與血液成分的相互作用，這些研究將繼續增加人們對轉移過程的了解。研究人員希望通過連續血液抽取對泌尿系腫瘤的CTC 分析運用到臨床： ①確定患者預后；②實時監測腫瘤復發和治療反應來改變癌癥治療的當前狀況；③識別新的治療靶點；④闡明耐藥機制；⑤改善筆者目前對腫瘤進展和轉移性疾病的理解。