抗重金屬鎘多克隆抗體的制備及純化

王澤祥，孫曉林

（甘肅農業大學動物醫學院，甘肅蘭州730070）

隨著人口的增長和城鎮化、農業現代化的迅速發展，環境污染日益加劇，其中農產品的污染也逐漸增多，特別是動物性食品中的重金屬污染現象越來越嚴重[1]。鎘（Cd）是生物毒性最強的重金屬之一，鎘化合物經人體消化道吸收后不易排出或者分解，會在人體內長時間存留，對人體造成不同程度的危害，尤其對肝臟和腎臟造成嚴重的傷害[2,3]。哺乳動物長期攝入鎘會導致排卵數目減少、卵細胞的受精能力和存活率降低、生育能力下降甚至不孕不育。此外，孕、產婦體內富集的鎘化合物可通過胎盤進入胎兒的組織器官，亦可通過乳汁排出傳播給嬰兒，對胎兒和嬰兒造成不同程度的損傷，如突變、致癌、致畸等[4-7]。鑒于動物性食品中的鎘元素給人類健康所帶來的巨大危害，建立高效、快速的重金屬鎘離子檢測技術對保障食品安全和人類健康具有十分重要的意義。

近年來，動物性食品中重金屬的檢測技術和方法已得到了較大提升和改進，在原子吸收光譜法、原子熒光光譜法和比色法等傳統檢測方法的基礎上，出現了電感耦合等離子質譜法、降級溶出伏安法等檢測方法[5,7-9]。然而，這些方法并不能滿足動物性食品中重金屬快速檢測、費用低和靈敏度高的要求。免疫學檢測技術，如熒光偏振免疫技術、免疫膠體金快速層析技術、酶聯免疫檢測技術，是一類新的重金屬離子檢測技術，具有檢測速度快、靈敏度高、費用低廉、操作方便等優勢[5,9-15]。重金屬離子酶聯免疫檢測技術（ELISA）的原理是通過將樣品中的重金屬離子與螯合物形成的復合物與包被在酶標板上的金屬-螯合物-蛋白質復合抗原競爭抗體的抗原結合位點，再利用酶標記的二抗進行顯色，與標準曲線對比得出重金屬離子的含量[12,13]。

本研究運用重金屬鰲合劑DTPA和鎘離子制備重金屬鎘完全抗原，免疫新西蘭大耳白兔，制備抗重金屬鎘離子的多克隆抗體，測定其效價，并進行純化，為建立快速、靈敏、特異的鎘離子ELISA檢測技術奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑

DTPA螯合劑、二甲基亞砜（DMSO）和葡聚糖凝膠Sephadex G200均購自索萊寶科技有限公司；鎘離子標準溶液、HEPES緩沖液、三乙胺、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自西格瑪奧德里奇（上海）有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

pH計（瑞士梅特勒-托利多公司）、超純水儀（美國Millipore公司）、磁力攪拌器（金壇市恒豐儀器廠）、冷凍離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）、電泳儀（美國Bio-Rad公司）、紫外分光光度計（美國Plextech公司）、脫色搖床（海門市麒麟醫用儀器廠）、超濾離心管（美國Millipore公司）。

1.3 實驗動物

健康新西蘭大耳白兔（2.0 kg左右）購于中國農業科學院蘭州獸醫研究所實驗動物廠。

1.4 金屬鎘完全抗原的制備

重金屬鎘離子完全抗原的制備過程：稱取50mg的DTPA溶于15mlDMSO中，在磁力攪拌器中緩慢溶解20 min，制備成金屬螯合劑溶液；稱取100 g牛血清白蛋白質（BSA），溶于HEPES緩沖溶液（10 mmol，pH 7.5）；將溶解的牛血清白蛋白溶液緩慢逐滴加入金屬螯合劑溶液中，然后加入500μL三乙胺溶液，在磁力攪拌器中緩慢攪拌均勻后反應24 h；使用100 mmol/L EDTA和0.1 mol/L、pH=7.4 HEPES緩沖液預處理的超濾管4℃、6 000 rpm離心超濾15 min去除未偶聯的DTPA；用pH 7.4的HEPES緩沖液洗取截留物，然后逐滴加入鎘離子標準溶液500μL，反應4 h后，4℃、6 000 rpm離心超濾30 min除去未螯合的鎘離子，再用pH 7.4的HEPES緩沖液稀釋截留物，-80℃保存備用。

1.5 金屬鎘完全抗原的鑒定

完全抗原應用SDS-PAGE電泳鑒定，取BSA、DTPA-BSA、Cd-DTPA-BSA分別用三蒸水稀釋到適當濃度，煮沸10 min，灌制12%濃縮膠和5%分離膠，加入電極緩沖液，每孔上樣量10μL，Marker按說明書處理，設定電壓為60 V，進行垂直SDS-PAGE電泳，電泳至溴酚藍指示劑離底線1 cm時停止，考馬斯亮藍染色20～30 min，脫色至透明。

1.6 重金屬鎘完全抗原蛋白質質量濃度測定

運用紫外分光光度計測定重金屬鎘離子完全抗原中蛋白質的質量濃度。

1.7 重金屬鎘多克隆抗體的制備

取5只體重2 kg的雄性新西蘭大耳白兔作為免疫動物，同時抽取免疫前的動物血清作為陰性對照。將制備好的免疫抗原0.5 mg與等體積的完全弗氏佐劑混合制成乳劑，采用皮下多點注射，完成初次免疫。4周之后，取0.5 mg免疫抗原與等體積不完全弗氏佐劑混勻，同法進行第二次免疫，此后每2周運用0.5 mg免疫抗原與等體積不完全弗氏佐劑免疫1次，于第五次免疫后1周心臟采血，分離血清，4℃保存備用。

1.8 多克隆抗體純化純度的測定

應用12% SDS-PAGE電泳檢測抗體純度，將SDS-PAGE電泳完成后的凝膠置于染色液中染色，之后放于脫色液中脫色，直至凝膠底色脫為無色，觀察染色條帶。

1.9 重金屬鎘多克隆抗體的純化

取抗體血清運用Sephadex G-200凝膠柱層析法純化多克隆抗體。具體步驟：第一，Sephadex G-200凝膠沸水浴5 h，冷卻至室溫后裝柱，保證柱內無氣泡且顆粒均勻。第二，用pH 7.4 PBS緩沖液平衡、洗脫。第三，收集不同峰時的抗體，裝入透析袋，周圍堆積PEG 6 000濃縮。濃縮后的多克隆抗體運用SDS-PAGE電泳檢測純度。

1.10 重金屬鎘多克隆抗體效價的測定

應用斑點ELISA法檢測抗重金屬鎘多克隆抗體的效價，取硝酸纖維素膜（NC膜）修剪成4 cm見方的方格，應用0.1 mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液浸泡10 min，室溫放置干燥后，將其用免疫抗原Cd-DTPA-BSA稀釋液1μL包被，室溫靜置1 h；用50 g/L的脫脂乳37℃封閉1 h，然后用PBST洗滌3次，每次5 min；室溫干燥后加入5μL梯度稀釋一抗，同時設立陰性對照，置于37℃孵育1 h，然后用PBST洗滌3次，每次5 min；加入5μL 1:10 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體，室溫放置30 min后用PBST洗滌3次，每次5 min；每格加入適量DAB顯色液，避光顯色5～10 min，終止反應后，觀察結果。

2 結果

2.1 重金屬鎘完全抗原Cd-DTPA-BSA的SDS-PAGE鑒定

通過蛋白質在SDS-PAGE中的遷移率來判斷各種抗原的相對分子質量的變化。合成的DTPA-BSA和Cd-DTPA-BSA相對于BSA均存在滯后現象，表明二者分子質量均有增加，且Cd-DTPA-BSA相當于DTPA-BSA也有滯后現象，表明前者比后者分子質量增加更大，這與理論上抗原合成成功現象相符（見圖1）。

2.2 免疫抗原的蛋白質濃度

運用紫外分光光度計法測定的蛋白質濃度為3.58 mg/ml。

2.3 SDS-PAGE電泳檢測抗體的純度

依據蛋白質分子Marker標記，運用凝膠柱層析法對制備的重金屬鎘多克隆抗體純化后的純度在80%以上（見圖2）。

2.4 斑點ELISA測定抗重金屬鎘多克隆抗體效價結果

經觀察，陽性反應為淡綠色斑點，斑點顏色隨著抗體滴度的升高而變淺，兔抗重金屬鎘多克隆抗體的效價為1:1 600。

3 討論

據統計，全球每年向環境中排放數萬噸的重金屬鎘，其中有很大一部分流向土壤和水源，從而污染飲用水和農產品。因環境中的重金屬降解非常緩慢，重金屬鎘會通過食物鏈進入家畜體內逐漸蓄積，從而污染動物性食品[5,14-16]。因此，快速靈敏的檢測動物性食品中的重金屬鎘殘留是保障食品安全和保護人類健康的重要措施。重金屬免疫學檢測技術已經逐漸發展成為動物性食品中重金屬殘留檢測的主流技術，該技術以抗體技術為基礎。重金屬離子本身無免疫原性，需要先與重金屬螯合劑形成復合物，通過載體如牛血清白蛋白（BSA）、雞卵白蛋白（OVA）偶聯復合物，從而形成完全抗原作為免疫抗原[9,17-18]。本研究應用雙功能螯合劑DTPA、牛血清白蛋白（BSA）與重金屬鎘離子標準溶液制備重金屬鎘完全抗原Cd-DTPA-BSA,采用弗氏免疫佐劑免疫新西蘭大耳白兔，大量制備抗重金屬鎘離子兔多克隆抗體，并應用凝膠柱層析法對制備的重金屬鎘多克隆抗體純化。所獲得的兔多克隆抗體效價較高，抗體純化效果較好，為下一步重金屬鎘離子ELISA試劑盒的開發奠定了基礎。