葛枳總黃酮口服脂質體的制備及質量評價

郭永梅 胥彥琪

化學性肝損傷是我國常見疾病之一，其發病率在呈現逐年上升的趨勢，且無有效的治療手段。根據現代研究表明，在人及哺乳動物的肝臟內，乙醇脫氫酶（ADH）和乙醛脫氫酶（ALDH2）構成了乙醇脫氫酶體系，參與體內乙醇代謝[1]。乙醇脫氫酶氧化體系是肝臟代謝酒精的一條重要途徑。葛根和枳椇子都是中國傳統醫學中極具代表性的護肝藥物，二者對化學性肝損傷均具有顯著的保護作用[2-3]，其主要有效成分為黃酮類的化合物，但其溶解度低、穩定性差、口服具有首過效應，生物利用度低，如何提高黃酮類天然藥物的生物利用度，一直是藥劑學領域的一個難題[4]。

脂質體作為一種新型藥物載體，具有提高制劑穩定性及藥物溶出的優點[5]。將PHTF 制備成口服脂質體制劑，以期其具備脂質體優點，并能克服傳統劑型生物利用度低的缺點，最終增加PHTF 在機體中吸收和口服生物利用度[6]。目前，尚無關于制備葛根-枳椇子配伍制備脂質體的報道，故本實驗將進行相關研究，并對PHTF 口服脂質體的質量進行評價。

1 儀器與材料

1.1 儀器

T6 紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；FA2004 電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；旋轉蒸發儀；JSM-7500F 掃描電鏡（日本電子株式會社）；MS-2000激光粒度分析儀（英國malvern 公司）；KQ3200DB 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL-16G 高速離心機（上海安亭科學儀器廠）

1.2 藥品及試劑

葛根總黃酮提取物（陜西森弗天然制品有限公司，批號：GGE20180722 總黃酮≥85.0%）；枳椇子總黃酮提取物（陜西森弗天然制品有限公司，批號：JJZ20180814 總黃酮≥75.0%）；蘆丁（中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-201810）；乙醇脫氫酶（sigma 公司，批號：A3263）、乙醛脫氫酶（上海源葉生物科技有限公司，批號：S10195）；β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+，Roche 公司）；磷酸二氫鉀（上海展云化工有限公司）、氫氧化鈉（上海展云化工有限公司）；大豆卵磷脂（德國Lipoid Gmbh 公司）；膽固醇（德國Merck 公司）。

2 方法與結果

2.1 PHTF 的配比對酶活性的影響

2.1.1 ADH/ALDH2 酶活性的測定方法

取具塞試管，加入pH7.4 磷酸鹽緩沖液2.0 ml、NAD+溶液0.188 mmol/ml，并加入一定濃度的樣品溶液及酶溶液（ADH 或ALDH2）0.2 ml，加蓋，25 ℃溫育5 min，加入相應的底物溶液，立即用紫外-可見分光光度計于340 nm 測定吸光度A 值，以后每隔10 s 讀數一次，連續測定5 min，記錄結果，計算酶活力激活率。

2.1.2 PHTF 配比對ADH 酶和ALDH2 酶活性的影響

將PTF 與HTF 分別按照5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1:5的比例進行配比，即得PHTF。分別精密稱取一定量不同比例的PHTF，制備成5.0 mg/ml 的供試品溶液，固定加樣量為0.5 ml。并對其復合物的酶激活能力進行研究。不同比例的PHTF 對ADH酶和ALDH2 酶的影響如圖1 所示。從圖中可以看出，當復合物中PTF 與HTF 的比例為1∶2 時，復合物對ADH 酶的激活率為59.3%，對ALDH2 的激活率為54.5%，均維持較高水平，因此確定PTF 與HTF 配比為1∶2。

圖1 葛根總黃酮-枳椇子總黃酮復合物對AND 酶和ALDH2酶活性的影響

2.2 PHTF 含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品10.32 mg，置于25 mL 容量瓶中，加60%乙醇適量，超聲溶解，再加60%乙醇稀釋至刻度搖勻，即得對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備

精密稱取一定量的PHTF（約相當于總黃酮10 mg），置于25 ml 容量瓶中，用適量60%乙醇超聲溶解，搖勻過濾，即得供試品溶液。

2.2.3 UV 檢測波長的確定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測定總黃酮含量。標準品和樣品溶液按顯色后，以隨行試劑為對照空白，于200～600 nm 波長范圍掃描，見圖2。標準品和樣品在508 nm 波長處均具有最大吸收，故確定檢測波長為508 nm。

2.2.4 標準曲線繪制

圖2 蘆丁標準曲線

精 密 吸 取對 照 品 溶 液1 mL，1.5mL，2mL，2.5mL，3mL，3.5 mL，置于10 ml 容量瓶中，按“2.2.3”項下方法顯色，以隨行試劑為對照空白，照紫外-可見分光光度法在508 nm 的波長處測定吸收度值。以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=5.1 460X+ 0.0 962（r = 0.9 996），結果表明，在0.0413 mg/mL～0.1445 mg/mL 范圍內與吸光度值呈良好的線性關系。結果如圖2。

2.3 工藝優化

2.3.1 脂質體制備采用逆向蒸發法

分別取大豆卵磷脂、膽固醇適量，溶于30 mL 無水乙醇中，作為有機相；取總黃酮適量，溶于10 mL PBS（PH7.0）中，作為水相。將水相與有機相混合，水浴超聲處理，直至形成均勻乳劑，移至梨形瓶中，水浴減壓除去無水乙醇，達到膠態后滴加適量PBS 溶液（PH7.0），繼續減壓蒸發使其充分水化，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3.2 脂質體包封率測定

采用離心法。精密量取脂質體1 mL，加50 mL 甲醇破乳后再稀釋10 倍，于508 nm 處測吸光度，計算PHTF 含量（W 總）。精密量取脂質體上清液1 mL，10 000 r/min 離心30 min，取上清液10 μL，甲醇定容至5 mL，測定吸光度，計算游離PHTF 含量（W 游），計算包封率。

2.2.3 藥物與卵磷脂比對包封率的影響

固定處方及工藝中的其他因素不變，改變卵磷脂：藥物（w/w）的比例，分別按6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1 制成PHTF 脂質體，測定其包封率分別為54.2%、58.3%、62.9%、59.6%、58.7%。結果表明藥物與卵磷脂的比例（w/w）為1∶10 時所制得的PHTF 脂質體包封率最高。

2.3.4 卵磷脂與膽固醇比例對包封率的影響

固定處方及工藝中的其他因素不變，改變卵磷脂：膽固醇（w/w）的比例，分別按2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1 制成PHTF 脂質體，測定其包封率分別為53.4%、56.7%、61.2%、59.3%、55.2%。結果表明卵磷脂與膽固醇的比例（w/w）為4∶1 時所制得的PHTF 脂質體包封率最高。

2.3.5 有機相與水相比例對包封率的影響

固定處方及工藝中的其他因素不變，改變有機相：水相（V/V）的比例，分別按1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1 制成PHTF 脂質體，測定其包封率分別為52.5%、58.6%、62.4%、59.4%、55.2%。結果表明卵磷脂與膽固醇的比例（w/w）為4∶1 時所制得的PHTF 脂質體包封率最高。

2.3.5 水浴溫度對包封率的影響

固定處方及工藝中的其他因素不變，考察水浴溫度分別為30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，制備PHTF 脂質體，測定其包封率分別為56.3%、58.3%、61.8%、60.3%、59.9%。結果表明，水浴溫度為40℃時，PHTF 脂質體包封率最高。

2.3.6 正交實驗優化

以包封率為主要指標，結合單因素試驗結果，對水浴溫度（A）；有機相與水相比例（V/V）（B）；卵磷脂與膽固醇比例（w/w）（C）；藥物與卵磷脂比（w/w）（D）；四個因素進行4 因素3 水平實驗，選用L9（34）正交表安排實驗，制備PHTF 脂質體，測定包封率。結果見表1。

從表中按極差R 值大小排序，C＞D＞B＞A，即卵磷脂與膽固醇的質量比是影響包封率的主要因素。按照A2B3C2D1 組合制備的PHTF 脂質體包封率為68.1%，優于其他組合的包封率。因此確定水浴溫度為40℃，有機相與水相的比例為4∶1，卵磷脂與膽固醇的比例為4∶1，藥物與卵磷脂比例為1:8 為最優處方。

表1 正交實驗結果

2.4 驗證試驗

按最優處方制備3 批PHTF 脂質體，測定其包封率分別為68.2%、68.4%、67.7%。平均包封率為68.1%。由測定結果可知該處方制備條件穩定可行。

2.5 PHTF 脂質體的質量評價

2.5.1 PHTF 脂質體的外觀形態

圖3 脂質體電子顯微鏡圖

按最優處方制備脂質體，外觀為淡黃色乳狀液體。PBS（PH7.0）稀釋至適當濃度，取適量滴于銅載體，1 min 后濾紙吸去多余樣液，2%磷鎢酸溶液進行負染，30 s 后濾紙吸去余液，晾干，于電鏡在觀察PHTF 脂質體形態并拍照，結果見圖3。由圖可見，脂質體外觀圓整，粒徑均一，為球狀或類球狀的小囊泡。

2.5.2 粒徑分布

取逆向蒸發法制得的PHTF 脂質體，純水稀釋后測定粒徑，平行3 次，結果見圖5，測得平均粒徑為（160.7±12.0）nm，粒度分布較為均勻。

2.5.3 Zeta 電位的測定

取PHTF 脂質體適量，純水稀釋后測定，結果見圖5，3 批脂質體Zeta 電位為（-41.4±2.3）mV，表明PHTF 脂質體具有較好的穩定性。

圖4 脂質體粒徑分布

圖5 脂質體Zeta 電位

2.5.4 PHTF 脂質體的載藥量

表2 總黃酮含量測定結果

取最優工藝制備的3 批PHTF 脂質體，通過離心法測定其載藥量，計算公式為，結果見表2。實驗證明逆向蒸發法制得的PHTF 脂質體具有較高的載藥量，符合要求。

2.5.5 穩定性考察

取3 批PHTF 脂質體置于玻璃瓶中，將其在室溫條件（25℃）下放置60d，分別于0、7、15、30、60d 觀察其形態變化、平均粒徑、包封率、Zeta 電位及pH 值，結果見表2。在60d 的穩定性考察中，PHTF 脂質體外觀無變化，無渾濁，平均粒徑、包封率、Zeta 電位及pH 值基本不變，說明PHTF 脂質體在25℃條件下60d 內穩定。

表3 穩定性考察結果

3 討論

本實驗采用逆向蒸發法成功制備PHTF 脂質體，并分別用單因素實驗考察了各個因素對制備脂質體的影響。在單因素實驗的基礎上用正交試驗進行了處方優化。考察了水浴溫度、有機相與水相比例（V/V）、卵磷脂與膽固醇比例（w/w）、藥物與卵磷脂比（w/w），結果顯示逆向蒸發法制備的脂質體方法簡單、效果良好。通過Valle-Hoch 法檢測不同比例的PHTF 對ADH 和ALDH2 的激活率的影響，確定PTF 和HTF 最優配比為1∶2。通過正交試驗確立了逆向蒸發法制備PHTF 脂質體的最佳處方為藥脂比1∶8，磷脂膽固醇比4∶1，有機相與水相比例4∶1。并確定了制備工藝中旋轉蒸發時的最佳水浴溫度為40℃。制得的PHTF 脂質體為淺黃色的液體。

通過三批次驗證試驗，測得PHTF 脂質體平均包封率為68.1%，平均總黃酮含量為18.40%，證明制備方法可行，具有較好的含藥量。并通過初步穩定性考察顯示，PHTF 脂質體在常溫條件（25℃）下具有良好的穩定性，60d 無明顯變化，從而確保了PHTF 脂質體用藥安全性和穩定性。

本次實驗僅考察了PHTF 體外分析方法的建立，且方法單一，不能有效評價PHTF 脂質體的藥效及生物利用度。后續課題組將建立系統的、多指標的評價分析方法，并進行體內的藥代動力學實驗。