雪旺細胞外泌體影響膠質(zhì)瘢痕形成修復(fù)小鼠脊髓損傷的實驗研究

潘大宇，寧廣智，馮世慶

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨科，天津市神經(jīng)科學(xué)院，中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)損傷后神經(jīng)修復(fù)和再生教育部重點實驗室，天津 300052）

脊髓損傷（spinal cord injury,SCI）后軸突嚴重受損和神經(jīng)元死亡，導(dǎo)致運動和/或感覺功能永久喪失，影響脊髓通過大腦向身體損傷部位以下控制感覺、運動以及自主功能的系統(tǒng)傳遞信息的能力[1-5]。雪旺細胞的外表面有基膜，能夠分泌營養(yǎng)因子來支持軸突生長，包括神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、膠質(zhì)細胞系神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)營養(yǎng)素[6-8]，能夠促進損傷后軸突的去分化和增殖，去除髓鞘和軸突碎片，其再生能力已被用于修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的損傷[9]。外泌體首先是在20世紀80年代被發(fā)現(xiàn)，并被描述為網(wǎng)狀細胞分泌的內(nèi)體衍生的小囊泡（30～150 nm），包含復(fù)雜的RNA和蛋白質(zhì)，直徑為40～100 nm的盤狀囊泡[10-11]。外泌體能夠充當(dāng)信號傳導(dǎo)體并將生物活性分子傳遞至特定的受體細胞以進行細胞間通訊[12]。研究表明，外泌體參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nerve system，CNS）的許多生物學(xué)過程，如突觸可塑性、髓鞘膜生物發(fā)生的調(diào)節(jié)以及將蛋白質(zhì)或者核酸局部轉(zhuǎn)運至高度極化的結(jié)構(gòu)[13-14]。而雪旺細胞外泌體（schwann cell-derived exosomes，SCDEs）最近引起了越來越多實驗團隊的注意，已經(jīng)有研究結(jié)果顯示，SCDEs包含mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)，并能夠在體內(nèi)外增強軸突的再生[17-18]。因此，本研究的目的是研究小鼠脊髓損傷后SCDEs在功能修復(fù)的作用及其可能的機制。本研究的發(fā)現(xiàn)可能有助于開發(fā)治療臨床脊髓損傷的新型治療策略。

1 材料與方法

1.1 雪旺細胞的原代提取和培養(yǎng) 由于雪旺細胞存在于外周神經(jīng)，所以本研究選擇大的外周神經(jīng)坐骨神經(jīng)來提取雪旺細胞。首先麻醉小鼠，然后使用頸椎脫臼法處死小鼠并用75%的乙醇全身消毒。將坐骨神經(jīng)分離出來后匯集到裝有無菌PBS的培養(yǎng)皿中，然后抽出PBS加入1 mL DMEM培養(yǎng)基（dulbecco′s modified eagle′s medium，DMEM） 和 300 μL 10 mg/mL 膠原酶孵育消化并分別用1 mL移液器吸頭、18 G和21 G針頭多次吸出和吹打組織，然后將細胞懸液通過70μm細胞過濾器濾入離心管中，500×g離心10 min后，丟棄上清液，用10 mL DMEM重疊細胞沉淀，輕輕搖動以均勻分布細胞，轉(zhuǎn)入到5%CO2的37℃恒溫箱中培養(yǎng)細胞1 d。第2天更換培養(yǎng)基。

1.2 SCDEs的提取 當(dāng)雪旺細胞傳至足夠的皿數(shù)并具有一定細胞密度后，更換培養(yǎng)基為不含F(xiàn)BS的DMEM進行培養(yǎng)，并每3 d收集1次雪旺細胞培養(yǎng)基，將收集到的培養(yǎng)基通過多次超速離心獲得SCDEs。第1次以1 000×g離心10 min，第2次以10 000×g離心30min。隨后，第3次收集上清液，并在100000×g下超速離心1h以沉淀外泌體。用PBS洗滌SCDEs后，在100 000×g下超速離心最后1 h后得到SCDEs。

1.3 SCDEs鑒定 先使用醋酸戊酯浸沒處理1 h，再用蒸餾水沖洗3次，然后浸沒在無水乙醇中以去除銅網(wǎng)上的污物，在無菌容器中備有一定量的無菌水，然后加入2%的火棉膠醋酸戊酯溶液于液面中央來制備支持膜，通過控制無菌水水流流速將支持膜轉(zhuǎn)移到載網(wǎng)上，然后制片后在透射電鏡下觀察。

1.4 SCI動物模型的建立和外泌體治療 由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心獲得6～8周齡雌性C57小鼠24只。給小鼠提供足夠的標準食物和水，并在12 h/12 h的明暗周期下飼養(yǎng)。術(shù)前稱重，并通過腹膜內(nèi)注射3 mL/kg的4%水合氯醛對小鼠進行深度麻醉。使用顯微剪對T10椎骨進行背側(cè)椎板切除術(shù)以暴露脊髓，將微型止血鉗橫向鉗夾暴露處整個脊髓5 s后松開，可觀察到小鼠痙攣性擺尾，雙下肢及軀體回縮撲動后雙下肢癱瘓，以及硬脊膜充血水腫，從而造成脊髓挫傷模型。假手術(shù)組除了不進行脊髓鉗夾，其他操作與上述操作一致。SCDEs治療組和PBS組均通過尾靜脈注射，每周2次，每次 3 μL/只。

1.5 免疫熒光染色 首先灌注取材，取出脊髓后4%多聚甲醛固定24 h，轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液中脫水24 h，然后冰凍包埋后切片，厚度為10 μm，置于37℃烘箱中烘烤1 h，后使用PBS復(fù)水5 min，加入封閉液封閉1 h，然后孵育一抗，置于濕盒中4℃過夜，所用一抗為5-HT、β-Ⅲ-tublin和GFAP。第2天將濕盒取出常溫復(fù)溫1h后用TBST洗3次，每次10min，避光常溫孵育二抗1 h。孵育完成后使用TBST洗3次，每次10 min，甘油封片后顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均表示為x±s。通過GraphPadPrism7軟件進行統(tǒng)計分析，并使用Student′st檢驗進行成對比較。使用帶有Tukey事后檢驗的Two-way ANOVAs分析確定行為學(xué)分析中的顯著差異，包括重復(fù)的數(shù)據(jù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SCDEs鑒定 本研究選用透射電子顯微鏡來觀測外泌體雙層囊膜超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，SCDEs的直徑范圍為40～100 nm，證實已經(jīng)分離出SCDEs（圖 1）。

圖1 SCDEs鑒定Fig 1 Identification of SCDEs

2.2 BMS評分 對于體內(nèi)實驗，本研究評估了SCI后使用 PBS 和使用 SCDEs治療第 1、3、5、7、14、28、42及56天的小鼠的恢復(fù)情況。通過對小鼠后肢運動功能評價，本研究發(fā)現(xiàn)在SCDEs治療組和PBS治療組小鼠的BMS評分之間存在統(tǒng)計學(xué)上顯著的時間依賴性變化，第28天P＜0.05，第42天P＜0.01，第56天P＜0.001。該發(fā)現(xiàn)表明，SCDEs改善了SCI后運動功能的恢復(fù)（圖2）。

圖2 BMS評分Fig 2 BMS score

2.3 SCDEs促進SCI后的神經(jīng)保護 為了研究SCDEs是否能夠促進SCI后的神經(jīng)保護，本研究在小鼠損傷部位檢測了5-HT和β-Ⅲ-tublin的表達水平。免疫熒光的結(jié)果表明，SCI后，和PBS處理組相比，SCDEs治療組的5-HT標記的神經(jīng)遞質(zhì)向下傳遞增多，同時β-Ⅲ-tublin標記的神經(jīng)在損傷區(qū)的分布密度增加而且損傷部位兩側(cè)正常神經(jīng)結(jié)構(gòu)的距離縮短（圖3）。

圖3 SCDEs對SCI后神經(jīng)保護的影響Fig 3 Effects of SCDEs on neuron protection after SCI

2.4 SCDEs促進SCI后神經(jīng)保護的定量分析 定量分析的結(jié)果表明，和PBS處理組相比，SCDEs治療組的5-HT和β-Ⅲ-tublin含量增高且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖 4，P＜0.01，P＜0.05）。

圖4 SCDEs對SCI后神經(jīng)保護的定量分析Fig 4 Quantitative data of SCDEs induced neuron protection after SCI

2.5 SCDEs治療增加SCI后膠質(zhì)瘢痕的形成 為探索SCDEs促進神經(jīng)學(xué)功能恢復(fù)的機制，通過檢測GFAP表達水平來觀察膠質(zhì)瘢痕的變化情況，免疫熒光的數(shù)據(jù)顯示，與PBS組相比，SCDEs組膠質(zhì)瘢痕表達增加，并且生長密度和延伸趨勢明顯（圖5）。

圖5 SCDEs對膠質(zhì)瘢痕形成的影響Fig 5 Effects of SCDEs on glial scar formation

2.6 SCDEs治療增加SCI后膠質(zhì)瘢痕形成的定量分析 定量分析的結(jié)果表明，與PBS組相比，SCDEs組膠質(zhì)瘢痕表達增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖6）。

圖6 SCDEs對膠質(zhì)瘢痕形成影響的定量分析Fig 6 Quantitative data of SCDEs affected glial scar formation

3 討論

本研究通過提取原代雪旺細胞并從其培養(yǎng)上清中超速離心出SCDEs，與PBS組相比，SCDEs組小鼠的行為學(xué)功能改善，神經(jīng)學(xué)功能指標具有顯著性改善，同時膠質(zhì)瘢痕形成增加。以上結(jié)果表明，SCDEs可以通過影響膠質(zhì)瘢痕的形成，從而增加神經(jīng)元的存活和修復(fù)小鼠脊髓損傷。

在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，軸突在神經(jīng)損傷后有效地再生，雪旺細胞在其中發(fā)揮重要作用[15]，而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，由于神經(jīng)元固有的局限性和限制再生的纖維瘢痕，再生能力差[16]。最近，有研究表明SCDEs包含mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)，并在體外和體內(nèi)增強軸突再生[17-18]。此外，該研究還證明，p75NTR存在于SCDEs中，是一種前體再生的蛋白質(zhì)。該蛋白在去分化的雪旺細胞中高表達，在病變區(qū)域豐富，并且p75NTR通過RhoA來調(diào)節(jié)生長錐狀絲狀偽足[14]。因此SCDEs的神經(jīng)保護作用越來越受到關(guān)注。但是真正將SCDEs應(yīng)用于中樞神經(jīng)損傷治療的研究屈指可數(shù)，本研究使用超速離心法分離出SCDEs進行小鼠脊髓損傷治療，觀察到SCDEs具有神經(jīng)保護作用，并可恢復(fù)小鼠行為學(xué)功能，由于SCDEs獲取相對比較困難，耗費時間長且成本投入高，所以如何更快更好的獲取足量的SCDEs可能是臨床轉(zhuǎn)化中一個非常重要的限制因素。

近年來，對于膠質(zhì)瘢痕的作用褒貶不一，之前很多學(xué)者認為膠質(zhì)瘢痕在SCI后更多的扮演一個物理阻隔的作用，限制了軸突的再生和神經(jīng)元的存活，而目前越來越多的研究顯示，膠質(zhì)瘢痕主要由星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞等構(gòu)成，這些細胞本身就是構(gòu)成軸突和支撐神經(jīng)元的重要膠質(zhì)細胞，所以它們的存在可以促進軸突的再生和神經(jīng)元的存活[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘢痕可以受到SCDEs的激活而表達增多，從而促進脊髓損傷后運動功能以及神經(jīng)學(xué)功能的修復(fù)，但是SCDEs如何影響膠質(zhì)瘢痕形成的機制還有待進一步研究。