α7nAChR-HDAC6通路在右美托咪啶降低幼鼠七氟烷神經毒性中的作用

朱敏，于洪麗，孫英，杜洪印，喻文立

（南開大學附屬天津市第一中心醫院麻醉科，天津300192）

嬰幼兒接受麻醉，特別是生長發育爆發期（3個月～2歲），神經系統容易遭到外界刺激傷害，導致成年后相關神經系統并發癥[1-2]。研究發現，新生大鼠七氟烷暴露可導致幼鼠前額葉皮層NMDA受體亞基組成發生變化，引起神經元退行性變以及成年后學習記憶受損[3]。右美托咪啶作為特異性更強的α2受體激動劑，具有獨特鎮靜、鎮痛及“交感切除”特點，廣泛應用臨床[4]。Dahmani等[5]發現，右美托咪啶減少神經元死亡及凋亡效應器caspase-3表達，可能與激活α2受體，促進灶性黏附激酶表達相關。課題前期發現右美托咪啶能夠降低七氟烷麻醉小兒術后譫妄發生率及術后惡心、嘔吐，但具體機制并未清楚。Wang等[7]發現幼鼠七氟烷暴露導致血清中炎性因子表達顯著增加[6]。α7煙堿型乙酰膽堿受體（α7nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR）為基礎的“膽堿能抗炎通路”可作用于免疫細胞，抑制炎癥因子釋放；Hui等[8]發現右美托咪啶預處理能夠增加神經迷走系統活性，而切斷迷走神經以及應用α7nAChR受體拮抗劑可降低右美托咪啶抑制炎癥反應。因此本研究旨在探討α7nAChR相關膽堿能通路在右美托咪啶降低小兒七氟烷暴露神經損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 7 d齡Sprague-Dawle（SD）幼鼠（中國人民解放軍軍事醫學科學院提供），采取隨機數字表法分為5組（n=40）：空白對照組（C組），七氟烷麻醉組（S組），右美托咪啶對照組（D組），七氟烷+右美托咪啶組（SD組），七氟烷+右美托咪啶+抑制劑MLA組（M組）。

1.2 動物模型的構建 將幼鼠置于3%七氟烷，以100%氧氣為載體，氣體流量4 L/min的培養箱2 h，連續3 d構建七氟烷模型。C組幼鼠置入培養箱前腹腔注射等體積生理鹽水；D組、SD組和M組腹腔注射25 μg/kg右美托咪啶；M組提前30 min注射3 mg/kg MLA，其余同前。麻醉過程中采用氣體監測儀（Drager，Lubeck，Germany）檢測麻醉箱內氧氣、二氧化碳、以及七氟烷濃度。

1.3 ELISA法檢測促炎因子和腦損傷標志物 灌注后斷頭取腦加入生理鹽水，4℃勻漿離心，收取上清液，采用ELISA試劑盒檢測腦組織促炎因子TNF-α、IL1β 和 IL-6，腦損傷標志物 S-100β 和NSE水平。具體實驗步驟參見說明書，最后計算得出相應因子濃度。

1.4 尼式染色檢測神經元存活情況 灌注后斷頭取腦，制備海馬區冠狀石蠟切片，厚度約10 μm，加溫脫蠟后無水乙醇浸泡，滴加尼式染色液，蒸餾水洗滌后脫水封片。采用BX-51光學顯微鏡觀察并照相，隨機選取CA1區連續不重疊視野，Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對神經元計數，取5個視野的平均值做統計分析。

1.5 Western印跡法檢測α7nAChR和HDAC6蛋白表達 斷頭取腦，游離幼鼠海馬組織，預冷組織蛋白裂解液勻漿，4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清為組織蛋白。成功提取蛋白進行定量檢測，將等量蛋白煮沸變性，經轉膜封閉洗滌等步驟后分別加入一抗α7nAChR和HDAC6抗體和β-actin抗體，4℃過夜清洗，二抗室溫孵育，曝光，掃描，采用Gene Tools圖像分析軟件測定條帶灰度值，以目的條帶灰度值與β-actin灰度值反映目的蛋白的表達情況。

1.6 Y迷宮實驗檢測幼鼠認知水平 41 d幼鼠進行Y迷宮實驗，Y迷宮隨機分為起始臂（S臂），新異臂（N臂）和其他臂（O臂），N臂內壁貼上不同圖形以作區別。采用Any-maze視頻軟件追蹤分析系統，記錄此時間段內大鼠在各臂的穿梭次數和停留時間，計算大鼠在N臂停留時間的比例，評價幼鼠空間識別記憶能力。

1.7 統計學分析 采用SPSS20.0統計軟件包進行數據處理，計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組促炎因子和腦損傷因子表達水平 與C組相比，S組、SD組和M組腦組織促炎因子TNF-α、IL1β、IL-6和腦損傷因子S-100β、NSE表達明顯增加（均P＜0.05）；與S組相比，SD組和M組相關因子表達降低（均P＜0.05）；與SD組相比，M組相關指標增加（均P＜0.05），見表 1。

2.2 各組幼鼠海馬CA1區神經元存活情況 與C組相比，S組、SD組和M組幼鼠海馬CA1區神經元排列稀疏，存活神經元數目明顯降低，差異具有統計學意義（均P＜0.05）；與S組相比，SD組和M組幼鼠海馬CA1區神經元排列稀疏程度改善，存活神經元數目明顯增加（均P＜0.05）；與SD組相比，M組幼鼠海馬CA1區神經元排列稀疏程度降低，存活神經元數目明顯降低（P＜0.05），見圖1和表2。

表1 各組幼鼠炎癥因子和腦損傷因子表達情況統計（x±s）Tab 1 Expression of inflammatory cytokines and brain injury factors in each group（x±s）

圖1 各組幼鼠海馬CA1區神經元尼氏染色鏡下存活情況（400×）Fig 1 Survival neurons in hippocampal CA1 area with Nissl staining of each group（400×）

表2 各組幼鼠海馬CA1區神經元存活情況比較（x±s）Tab 2 Comparison of survival neurons in hippocampal CA1 area of each group（x±s）

2.3 各組幼鼠海馬組織α7nAChR和HDAC6蛋白表達情況比較 與C組相比，S組、SD組和M組幼鼠海馬組織α7nACh表達降低，HDAC6增加（均P＜0.05）；與S組相比，SD組和M組α7nAChR表達增加，HDAC6減少（均P＜0.05）；與SD組相比，M組α7nAChR表達降低，HDAC6增加（均P＜0.05），見圖2和表3。

圖2 各組幼鼠海馬組織α 7nAChR和HADC6蛋白表達Fig 2 Expression of α 7nAChR and HDAC6 in hippocampus of each group

表3 各組幼鼠海馬組織α7nAChR和HADC6蛋白（%con組）表達統計（x±s）Tab 3 Expression of α7nAChR and HADC6(%con group)in hippocampus of each group（x±s）

2.4 各組幼鼠新異臂停留時間比較 與C組相比，S組、SD組和M組幼鼠新異臂停留時間比例明顯降低，差異具有統計學意義（均P＜0.05）；與S組相比，SD組和M組幼鼠新異臂停留時間比例顯著增加（均P＜0.05）；與D組相比，M組幼鼠新異臂停留時間降低（P＜0.05），見表 4。

表4 各組幼鼠新異臂停留時間比較（x±s）Tab 4 Comparison of time in N arm(%of 60 s)in each group（x±s）

3 討論

嬰幼兒處于大腦神經網絡系統形成的關鍵時期[1]，特別是處于生長發育爆發期時，更容易遭受外界如手術麻醉等刺激傷害，進而導致成年相關神經系統并發癥。Wilder等[9]臨床研究表明，年齡小于3歲、接受多次麻醉暴露或者麻醉時間超過3 h的患兒，其在成年后學習能力明顯低于正常年齡段小兒。七氟烷因其血氣分配系數低，呼吸道刺激弱，便于快速誘導和蘇醒，廣泛應用于小兒臨床麻醉[10]。研究發現學齡前兒童實施七氟烷麻醉可顯著增加術后譫妄的發生率[11]。動物實驗發現七氟烷暴露導致幼鼠神經元細胞發生內質網應激、線粒體功能障礙、神經炎癥以及神經突觸發生障礙等相關變化，可能導致遠期認知障礙，但具體機制并未完全清楚[12]。因此，探究幼鼠七氟烷麻醉暴露所致神經損傷及遠期認知功能障礙的機制以及保護措施具有重要的意義。

神經炎癥在幼鼠七氟烷麻醉暴露所致神經損傷中扮演著重要作用。Wang等[7]發現幼鼠暴露于4.1%七氟烷6 h可激活NF-κB通路增加血清IL-6和TNF-α表達。C57出生6 d小鼠暴露3%七氟烷2 h，連續3 d導致其遠期認知功能水平下降，其機制與神經炎性相關[13]。本研究發現幼鼠七氟烷暴露可導致腦組織促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6和腦損傷因子表達顯著增加。研究表明，α7nAChR介導的膽堿能抗炎通路是神經免疫細胞發揮抗炎作用的重要機制[14]。右美托咪啶作為特異性α2受體激動劑能夠增加迷走神經活性，改善內毒素動物炎性模型愈后。本研究發現七氟烷暴露導致α7nAChR表達下降，而右美托咪啶處理可顯著增加α7nAChR表達，提升迷走神經活性，抑制促炎因子釋放，發揮抗炎保護作用。

HDAC6是唯一催化多種胞漿蛋白而非組蛋白的去乙?；?，主要表達于神經元胞漿，參與神經系統軸突運輸、突觸傳遞、神經炎癥等生物學反應[15]。Akimova等[16]發現抑制HDAC6表達可增加Foxp3表達及乙?；剑龠MTreg細胞抑制炎癥反應。神經發育期幼鼠多次七氟烷暴露可導致HDAC6表達及活性增加，并介導神經突觸限制性發育及影響成年大鼠認知行為能力[17]。而α7nAChR蛋白激活可顯著抑制HDAC6表達及生物活性，有效改善神經突觸可塑性及認知水平[18]。本研究結果表明七氟烷暴露可增加幼鼠海馬組織HDAC6蛋白表達，而右美托咪啶可以顯著降低HDAC6表達；同時α7nAChR受體拮抗劑MLA可有效逆轉右美托咪啶介導的HDAC6抑制作用，降低抗炎作用。

綜上所述，右美托咪啶降低七氟烷麻醉暴露所致膽堿能抑制作用，增加膽堿能受體α7nAChR表達，抑制組蛋白去乙?；窰DAC6表達，進而抑制七氟烷神經炎癥毒性反應及神經發育障礙作用，發揮神經保護。