TGF-β/SMAD4信號通路中基因突變對胰腺癌患者生存的影響

方闖，田偉軍

（天津醫科大學總醫院普通外科，天津300052）

在近幾十年中胰腺癌的發病率及死亡率都在持續上升，預計到2030年胰腺癌將成為美國第二位腫瘤相關的死因[1-2]。在中國2015年癌癥相關死亡人數約有2 814 000人，平均超過7 500人/年，其中胰腺癌的發病率呈逐年升高的趨勢且其成為癌癥相關死亡的前10位腫瘤[3]。胰腺癌診斷較為困難，其早期缺乏特定的癥狀和體征，超過80%的患者在確診時已經是不可切除或有遠處轉移[4]。90%的胰腺癌為導管腺癌，其對現有的放療和化療不敏感，從而使得其5年生存率小于8%。轉化生長因子（TGF）-β信號通路在胰腺導管腺癌中具有正向調節腫瘤生長的作用，SMAD4蛋白作為此信號通路中關鍵的分子，在此通路功能中具有較為重要的作用。

隨著生物技術的進步和基因高通量檢測的發展，DNA微陣列技術和二代檢測技術的應用使得個體化基因檢測成為了可能。研究證實胰腺癌包含多基因和多靶點的突變，這使得胰腺癌患者之間存在較大的異質性，相同的化療方案在不同患者間的整體收益相差較大。本研究進行了胰腺導管腺癌患者基因突變的NGS測序，并同時回顧性總結了其臨床資料，分析了TGF-β/SMAD4信號通路上關鍵位點基因突變的情況，探究了SMAD4基因突變對患者生存的影響，以期為一部分胰腺導管腺癌患者的臨床預后提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2016年7月1日-2019年9月1日天津醫科大學總醫院收治，術后病理確診為胰腺導管腺癌的患者19例，隨訪資料完整，最后回訪截止日期為2019年9月1日。患者臨床獲取病理時記為生存起始時間，主要及次要終點事件分別為患者死亡與隨訪結束。收集患者的臨床特征、血液學檢查、腫瘤分期及存活時間等。

1.2 方法 手術中留取胰腺腫瘤患者新鮮腫瘤組織樣本2份，將其分別浸泡于10%中性福爾馬林溶液中。第一份先行病理診斷，待病理診斷結果返回后，將病理診斷為胰腺導管腺癌的患者的第二份腫瘤組織樣本行基因檢測。收集醫院病理回報為胰腺導管腺癌的患者的基因突變情況和隨訪的臨床數據。訪問dbSNP及COSMIC數據庫，對TGF-β/SMAD4信號通路上的基因突變的情況及臨床意義進行總結。

1.3 統計學處理 本組數據采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，取α=0.05為檢驗水準。采用Kaplan-Meier生存分析法和對數秩和檢驗分析，率的比較采用χ2檢驗，單因素分析采用Log-Rank檢驗。

2 結果

2.1 一般臨床特征 19例胰腺導管腺癌患者的一般臨床資料如表1所示。

2.2 基因檢測結果 利用NGS技術對19例胰腺導管腺癌患者的組織標本進行360個基因的測序，結果顯示：19例患者中共出現63個基因突變和115個變異位點。19例胰腺導管腺癌患者的基因突變檢測結果如圖1所示：最常見的突變基因是KRAS（84.2%）、TP53（68.4%）、SMAD4（26.3%）、CDKN2A（26.3%）、CREBBP（15.8%）、RNF43（15.8%）、BRAF（15.8%）等。

表1 胰腺導管腺癌患者的臨床資料Tab 1 Clinical characteristics of patients with pancreatic cancer

圖1 19例患者63個基因的115個位點的突變熱圖Fig 1 Mutant heat maps of 115 loci in 63 genes of 19 patients

19例胰腺導管腺癌患者中具有TGF-β/SMAD4信號通路（SMAD4/SMAD3/TGFBR1/TGFBR2）相關基因突變的患者有7例（36.8%），5例患者具有SMAD4基因突變（2例為內含子位點的突變），其中SMAD4基因突變患者中有2例患者同時具有TGFBR1基因的突變；1例患者具有SMAD3基因突變，1例患者具有TGFBR2基因突變，詳見表2，其余患者未檢測到此通路相關的基因突變。

表2 TGF-β/SMAD4信號通路中各基因突變情況Tab 2 Gene mutations in TGF-β/SMAD4 signaling pathway

19例胰腺導管腺癌患者中，此信號通路中基因突變的類型包括錯義突變（6例）、剪切突變（2例）和無義突變（1例），各基因突變豐度在8.03%～46.30%且各不相同。各基因突變位點的臨床意義包括致病與潛在致病。

2.3 生存分析 19例患者隨訪截至2019年9月1日，死亡10例（52.6%），存活9例（47.4%）。中位總生存期（median overall survival，mOS）為 14.0個月（95%CI：3.4～24.6）。將具有SMAD4基因突變的患者記為SMAD4基因突變組，無SMAD4基因突變患者記為無SMAD4基因突變組，其他各基因突變的生存分析依次進行。

患者突變基因特征與其生存的關系顯示，SMAD4基因突變組中位生存時間5.0個月，無SMAD4基因突變組中位生存時間14.0個月，差異有統計學意義（χ2=4.583，P=0.032），見圖 2。其他生存分析顯示以KRAS基因突變分組、TP53基因突變分組及CDKN2A基因突變分組所得的生存分析均無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

胰腺導管腺癌是致死性較高的疾病，在過去幾十年里其臨床治療均未取得實質性進展，一線標準化療方案中吉西他濱聯合白蛋白紫杉醇OS為8.5個月，FOLIRNOX方案的OS為10.2個月[5-6]。近期研究表明胰腺導管腺癌基因突變具有復雜性，一方面，在胰腺導管腺癌的發生、發展中具有高頻的突變基因，例如KRAS、TP53等，另一方面，它具有大量的中低頻突變基因，例如SMAD4、ATM、FANCG等[7-9]。胰腺導管腺癌中KRAS基因突變頻率為70%～95%，TP53基因突變為75%，SMAD4基因突變為50%[10-12]，大致與本研究中各基因突變頻率相近。針對KRAS、TP53、CDKN2A等高頻突變基因的研究，其臨床治療應用收益甚微[13-15]。因此，能否通過研究及治療具有SMAD4基因突變的患者來提高胰腺導管腺癌的整體生存率成為了未來胰腺導管腺癌治療的可能方向之一。

圖2 SMAD4基因突變組與無SMAD4基因突變組生存分析Fig 2 Survival analysis of SMAD4 mutant group and no SMAD4 mutant group

TGF-β/SMAD4信號通路在腫瘤組織中起到了一個復雜的雙向作用。在腫瘤早期，TGF-β/SMAD4信號通路負向調節腫瘤生長，而在腫瘤進展期或晚期，則正向調節腫瘤生長。胰腺導管腺癌SMAD4基因變異使得SMAD4蛋白活性減低，必然導致TGF-β信號通路遭到破壞，從而失去對腫瘤細胞增殖的抑制作用。本研究中具有SMAD4基因突變的患者相較于SMAD4基因未突變的患者具有更差的生存預后，這也進一步說明SMAD4基因突變具有促進胰腺導管腺癌進展的作用。SMAD4蛋白是介導TGF-β信號從細胞漿進入到細胞核的關鍵分子[16]。在胰腺導管腺癌中，SMAD4基因缺失可以使得KRAS誘導的癌癥過程加速[17]，并且SMAD4蛋白隨著胰腺癌分化程度的降低而減少[18]。SMAD4蛋白表達的減少預示著胰腺導管腺癌患者更差的預后[19]。而有研究表明SMAD4蛋白表達缺失的可切除胰腺導管腺癌患者相對于SMAD4蛋白正常表達的可切除胰腺導管腺癌患者行術后輔助治療后，前者具有更高的局部和遠處轉移率，而生存率卻沒有統計學差異[20]，此可能為SMAD4蛋白是基因轉入與翻譯后的產物，其受到多種途徑的調節。本研究為胰腺導管腺癌患者基因層面與生存分析的結果，可為胰腺導管腺癌提供臨床預后評估指標，為新的靶向治療提供參考靶點。

5例SMAD4基因突變的患者中存在2例TGFBR1基因突變的患者，他們分別僅存活2個月及5個月，前者TGFBR1S241L基因突變豐度較高（45.13%），后者TGFBR1N338I基因突變豐度較低（8.03%）。同時具有2個TGF-β/SMAD4信號通路中關鍵基因突變的患者臨床預后比此通路中單基因突變患者的生存較差，且生存時間與基因突變豐度有一定關系。

本研究僅為單中心胰腺導管腺癌患者的臨床及基因突變的分析及報道，通過臨床資料匯總，對高頻突變基因及TGF-β/SMAD4信號通路上基因突變做了初步分析，有待進一步行多中心、大樣本、RNA及蛋白表達層面的驗證。

TGF-β/SMAD4信號通路中具有SMAD4基因突變患者的臨床預后相較于無基因突變患者的臨床預后更差。此通路中具有SMAD4基因突變的患者同時發生TGFBR1基因突變的生存時間較短且其基因突變豐度較高。本研究為胰腺導管腺癌患者的臨床預后提供參考，為胰腺導管腺癌靶向治療提供新的參考靶點。