碳青霉烯耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的臨床特征及克隆變遷

孔海芳，胡志東

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，天津300052）

鮑曼不動(dòng)桿菌是院內(nèi)感染的常見(jiàn)條件致病菌，當(dāng)患者有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病、免疫力低下或接受侵襲性操作時(shí)，可引起嚴(yán)重感染，如呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、菌血癥、泌尿道感染、傷口感染以及繼發(fā)的腦膜炎等[1]。隨著廣譜抗菌藥物的使用，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)臨床常見(jiàn)抗生素的耐藥性不斷增加，碳青霉烯類藥物作為治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染的最后一道防線，其耐藥性也日趨嚴(yán)重，2018年CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)報(bào)道，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為73.2%和73.9%[2]。近年來(lái)，碳青霉烯耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌（Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）呈現(xiàn)多重耐藥、泛耐藥甚至全耐藥傳播，且以克隆傳播的方式在醫(yī)院之間或醫(yī)院內(nèi)進(jìn)行傳播，給公共衛(wèi)生和臨床抗感染治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。筆者通過(guò)研究天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院CRAB的臨床特征、耐藥機(jī)制以及流行病學(xué)情況，旨在為臨床CRAB的診療和預(yù)防提供有力的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 收集天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2011年1月—2018年12月無(wú)菌體液及下呼吸道標(biāo)本［肺泡灌洗液和痰］中分離出CRAB 242株，同一患者僅選取首次培養(yǎng)陽(yáng)性的菌株。臨床分離標(biāo)本有腹腔引流液、全血、分泌物、引流液、PICC導(dǎo)管、胸腔積液、腦脊液、尿液、膽汁、痰、肺泡灌洗液。

1.1.2 儀器和試劑 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（matrix-assistedlaserdesorptionionizationtime of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）和藥敏卡AST-GN16（法國(guó)生物梅里埃公司），9700型PCR儀（美國(guó)Perkin Elmer公司）；限制性內(nèi)切酶XbaI和ApaI（大連寶生物制品有限公司），Easy Taq酶、10×Buffer、dNTP、DNA Mark（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。Tris、硼酸、EDTA、溴化乙錠（EB）、十二烷基肌氨酸鈉、低溶點(diǎn)膠、蛋白酶K、引物（上海生工生物工程股份有限公司）；去氧膽酸、Brij 58（美國(guó)Sigma公司）；PFGE瓊脂糖（美國(guó) Bio-Rad公司）；瓊脂糖（上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定及藥敏試驗(yàn) 采用MALDI-TOF MS對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，AST-GNl6藥敏卡做藥敏，紙片擴(kuò)散法檢測(cè)頭孢哌酮/舒巴坦，折點(diǎn)參考頭孢哌酮，結(jié)果判讀參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）2019年標(biāo)準(zhǔn)[3],替加環(huán)素參照美國(guó)食品藥品監(jiān)督局(FDA)判定折點(diǎn)[4]。以大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853作為藥敏的質(zhì)控菌株，所有操作嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行。

1.2.2 碳青霉烯酶基因檢測(cè) 采用多重PCR檢測(cè)D類OXA型碳青霉烯酶（OXA-51-like、OXA-23-like、OXA-58-like、OXA-24-like），引物合成及擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[5]；采用單一PCR檢測(cè)B類金屬β-內(nèi)酰胺酶（VIM、NDM、IMP、SIM），引物合成及擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[6]。

1.2.4 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE） 參照文獻(xiàn)[7-8]提出的鮑曼不動(dòng)桿菌PFGE方案進(jìn)行試驗(yàn)，以Salmonella enterica serotype Braenderup strain H9812作為PFGE標(biāo)準(zhǔn)分子量。PFGE圖譜判讀參照Tenovel等[9]提出的標(biāo)準(zhǔn)：PFGE條帶相差≥7條為流行病學(xué)的不同克隆。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用x±s或中位數(shù)（M）表示，采用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例（百分?jǐn)?shù)）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Whonet5.6軟件統(tǒng)計(jì)分析藥敏結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 CRAB感染的基本情況 242株CRAB主要來(lái)源于下呼吸道標(biāo)本，其次為尿液和血液；47.9%的患者來(lái)源于ICU。感染CRAB患者男性151例，女性91例，平均年齡（60.7±19.1）歲。分離菌株前患者住院時(shí)間平均為18 d，患者入院時(shí)APACHⅡ評(píng)分為（21.60±9.90）分，分離菌株前3個(gè)月內(nèi)使用碳青霉烯類抗生素患者占53.3%（129/242）,使用三代頭孢菌素占44.2%（107/242），1個(gè)月內(nèi)進(jìn)行手術(shù)患者占58.3%（141/242），進(jìn)行機(jī)械通氣患者占81.0%（196/242），中央靜脈插管患者占52.9%（128/242）,感染CRAB患者的死亡率為26.4%（64/242）。

2.2 CRAB藥敏試驗(yàn)結(jié)果和碳青霉烯酶基因檢測(cè) 所有菌株均為多重耐藥菌。CRAB對(duì)不同抗生素的耐藥性如下：阿米卡星為21.2%，慶大霉素為74.9%，環(huán)丙沙星為92.1%，左氧氟沙星為54.1%，頭孢哌酮/舒巴坦為18.4%，替加環(huán)素為5.5%，亞胺培南均耐藥，未發(fā)現(xiàn)對(duì)多黏菌素耐藥的菌株。

242株CRAB均有blaOXA-51基因,證實(shí)為鮑曼不動(dòng)桿菌，97.5%的菌株攜帶blaOXA-23基因，所有菌株未檢測(cè)出blaOXA-24-like、blaOXA-58-like、blaIMP、blaVIM、blaSIM、blaNDM基因。

2.3 CRAB克隆變遷 經(jīng)PFGE分型表明2011—2015年CRAB的克隆型發(fā)生明顯變遷，2016—2018年CRAB菌株85%以上均為A克隆型，現(xiàn)將2011-2015年79株CRAB進(jìn)行分型。79株CRAB分為15種（A～O）PFGE克隆型（圖 1），其中 A 和 C 是主要流行克隆型，A型占46.8%（37/79）、C型占25.3%（20/79）。5年內(nèi)克隆變遷情況見(jiàn)圖2。2011—2013年CRAB總例數(shù)逐年增加，2014年有所下降后，2015年又迅速上升。2011年CRAB菌株呈現(xiàn)散發(fā)；2012年以 C型為主占77.8%（7/9）；2013年以A型和C型為主，A型占35.3%（6/17），C型占29.4%（5/17）；2014年以A 型為主占 83.3%（10/12）；2015年以A型為主占61.8%（21/34）。C型一直貫穿2011—2015年，2012年成為主要的克隆型，2013年A型開(kāi)始出現(xiàn)，并取代C型成為2013—2015年主要克隆型，且分離菌株數(shù)逐年增加，B型主要出現(xiàn)在2013年，2015年僅分離到1株。A克隆型對(duì)亞胺培南高度耐藥（MIC50=64 μg/mL、MIC90=128 μg/mL），對(duì)美羅培南中度耐藥（MIC50=16 μg/mL、MIC90=64 μg/mL），且與碳青霉烯類抗生素（χ2=5.80，P=0.016）和中央靜脈插管有關(guān)（χ2=5.80，P=0.016）；C 克隆型對(duì)亞胺培南中度耐藥（MIC50=16 μg/mL、MIC90=64 μg/mL），對(duì)美羅培南低度耐藥（MIC50=8 μg/mL、MIC90=32 μg/mL），且與三代頭孢菌素的使用相關(guān)（χ2=4.65，P=0.031），A克隆型及C克隆型患者的死亡率分別為12.7%（10/79）及 5.06%（4/79），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.346，P＞0.05），見(jiàn)表 1。

圖1 79株CRAB感染菌株P(guān)FGE聚類分析樹(shù)狀圖Fig 1 Dendrogram of 79 A.baumannii nosocomial isolates analyzed by PFGE

圖2 2011—2015年CRAB菌株克隆變遷情況Fig 2 Annul distribution of the isolates,major endemic pulsotypes,and trend line of CRAB from 2011 to 2015

表1 2011—2015年CRAB菌株主要流行菌株的臨床特征Tab 1 Characteristics of predominant clones of Acinetobacter baumannii from 2011 to 2015

3 討論

CRAB的出現(xiàn)和流行，給臨床抗感染治療帶來(lái)極大困難，現(xiàn)已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，由于CRAB具有快速獲得和傳播耐藥性的能力，多重耐藥、泛耐藥甚至全耐藥菌株在世界范圍內(nèi)流行[10]。CRAB在ICU、神經(jīng)外科病房極易流行，且病死率高，目前仍沒(méi)有特效抗生素治療，因此合理的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和干預(yù)成為亟待解決的實(shí)際問(wèn)題。報(bào)道稱使用碳青霉烯類抗生素、入住ICU、機(jī)械通氣、氣管插管等是CRAB感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[11-13]。本研究47.9%的患者入住ICU，53.3%的患者3個(gè)月內(nèi)使用過(guò)碳青霉烯類抗生素，58.3%的患者1個(gè)月內(nèi)進(jìn)行過(guò)手術(shù)，81.0%的患者進(jìn)行過(guò)機(jī)械通氣，52.9%的患者接受過(guò)中央靜脈插管，患者死亡率為26.4%，高于之前報(bào)道[14]，可能的原因是患者入住ICU，多合并嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病，接受中央靜脈插管、留置導(dǎo)尿管、機(jī)械通氣，廣泛使用抗生素等加速患者的死亡。

碳青霉烯酶是CRAB的主要耐藥機(jī)制，主要包括B類金屬酶和D類苯唑西林酶，以D類酶最常見(jiàn)。OXA-51是鮑曼不動(dòng)桿菌天然染色體介導(dǎo)的OXA酶，正常情況下不表現(xiàn)水解碳青霉烯類抗生素的活性，其他OXA酶均為外源性獲得，具有水解碳青霉烯類抗生素的活性,其中OXA-23在世界各大洲都有發(fā)現(xiàn)，是臨床分離CRAB最主要的碳青霉烯酶[15-17]。本研究97.5%的CRAB均攜帶blaOXA-23基因，OXA-23是醫(yī)院CRAB最主要的碳青霉烯酶。吳海燕等[18]發(fā)現(xiàn)產(chǎn)OXA-23型碳青霉烯酶的CRAB是山東省泰安市某院流行的主要克隆型。張吉生等[19]同樣發(fā)現(xiàn)中國(guó)佳木斯某醫(yī)院OXA-23型碳青霉烯酶是CRAB主要的耐藥機(jī)制。Liu等[20]發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pAZJ221和轉(zhuǎn)座子Tn2009與鮑曼不動(dòng)桿菌blaOXA-23基因廣泛流行相關(guān)，這也是鮑曼不動(dòng)桿菌blaOXA-23基因在各地區(qū)水平傳播的主要原因。

為了更好的了解院內(nèi)感染鮑曼不動(dòng)桿菌流行病學(xué)和傳播能力，許多分子分型技術(shù)得以引入，PFGE分型方法重復(fù)性好、分辨率高、結(jié)果穩(wěn)定，是細(xì)菌分子生物學(xué)分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[21]。本研究共分離出15種克隆型，以A和C克隆型為主，2012年以攜帶blaOXA-23基因的C克隆型為主，這一克隆型對(duì)亞胺培南中度耐藥（MIC50=16 μg/mL），對(duì)美羅培南低度耐藥（MIC50=8 μg/mL），且這一克隆型與三代頭孢菌株的使用有關(guān)；2013年攜帶blaOXA-23基因的A克隆型出現(xiàn)后成為主要的流行菌株，A克隆型對(duì)亞胺培南高度耐藥（MIC50=64 μg/mL），對(duì)美羅培南中度耐藥（MIC50=16 μg/mL），這一克隆型與碳青霉烯類抗生素的使用、中央靜脈插管相關(guān)。在本研究中，碳青霉烯類抗生素的使用不斷增加，頭孢菌素類抗生素的使用有所下降，這可能也是導(dǎo)致C克隆型向A克隆型轉(zhuǎn)變的一個(gè)原因，同時(shí)說(shuō)明廣譜抗生素使用的選擇壓力，不但沒(méi)有完全殺死鮑曼不動(dòng)桿菌，反而使鮑曼不動(dòng)桿菌持續(xù)存在且不斷進(jìn)化[22]。吳偉元等[23]研究深圳市8年CRAB的感染特征和克隆變遷情況，發(fā)現(xiàn)深圳市以攜帶blaOXA-23-like基因的高耐藥CRAB為主，并且D克隆型逐漸取代A克隆型和C克隆型成為主要的克隆株型。

從菌株的時(shí)間和空間分布上分析，ICU是CRAB的主要分布區(qū)，ICU患者往往合并多種基礎(chǔ)疾病，常有侵入性操作，廣泛使用抗生素等危險(xiǎn)因素，易感染耐藥菌株，也是各大醫(yī)院分離CRAB較多的科室。A和C克隆型在各個(gè)科室都存在，說(shuō)明CRAB已經(jīng)在各個(gè)科室傳播，科室間存在交叉感染的可能性，這種傳播可能是導(dǎo)致醫(yī)院CRAB不斷增加的原因之一，耐藥克隆菌株的傳播往往借助人工呼吸機(jī)等設(shè)施和醫(yī)護(hù)人員的手進(jìn)行傳播，因此醫(yī)護(hù)人員要勤洗手，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作和消毒規(guī)范，發(fā)現(xiàn)感染患者要及時(shí)隔離等。

目前在臨床治療過(guò)程中，鮑曼不動(dòng)桿菌因其較高的耐藥性，導(dǎo)致感染患者較高的致死率。因此在缺乏有效的、新的抗菌藥物的情況下，臨床醫(yī)生應(yīng)合理使用目前現(xiàn)有的抗生素治療鮑曼不動(dòng)桿菌的感染。中國(guó)鮑曼不動(dòng)桿菌感染診治與防控專家共識(shí)中指出，多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的治療建議使用兩藥聯(lián)合甚至三藥聯(lián)合治療，主要包括以舒巴坦為基礎(chǔ)的聯(lián)合、以替加環(huán)素為基礎(chǔ)的聯(lián)合和以多黏菌素為基礎(chǔ)的聯(lián)合[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，醫(yī)院鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢哌酮舒巴坦、替加環(huán)素以及多黏菌素的耐藥性均較低，因此建議醫(yī)院醫(yī)生根據(jù)疾病程度和藥敏結(jié)果合理選擇抗生素，聯(lián)合治療，爭(zhēng)取達(dá)到療效最大、毒性最小的治療效果，這將對(duì)于減少耐藥菌株的產(chǎn)生和控制CRAB的感染具有重要的意義。

綜上所述，攜帶blaOXA-23基因的CRAB高耐藥A克隆型菌株在醫(yī)院已經(jīng)流行，應(yīng)切實(shí)采取積極有效的措施，并對(duì)CRAB菌株進(jìn)行持續(xù)流行病學(xué)研究，以預(yù)防和控制CRAB的進(jìn)一步傳播。