牛蒡根氯仿提取物有效組分分離及其抗腫瘤活性的研究

沈洪昇，何景華，趙秀梅，顧娜，史鵬程，胡人杰

（1.天津醫科大學基礎醫學院藥理學教研室，天津300070；2.天津市醫藥科學研究所，天津300020）

惡性腫瘤是危害人類健康的主要疾病之一。腫瘤的三大療法中，藥物治療占有重要的地位。很多來源于天然產物的單體或有效組分的抗腫瘤作用及其機制已經得到公認，不僅為癌癥治療提供了新的理論及依據，也為抗腫瘤藥物的篩選提供了廣闊的空間。牛蒡（Arctiumlappa L．）是菊科牛蒡屬草本植物，其根、莖、葉、果實均可作為草藥使用[1]。目前研究主要集中于法定的藥用部位牛蒡子，其有效成分牛蒡子苷具有明確的抗腫瘤活性[2]。牛蒡根尚未列為藥用部位，但所含的營養成分較豐富，已作為蔬菜及保健食品廣為食用[3]。牛蒡根具有抗細菌和真菌作用，也可降血脂、保護肝臟[4-6]。筆者的前期研究發現，牛蒡根提取物對某些腫瘤細胞存在一定的抑制作用，并對化療藥物有減毒增效的作用[7]。進一步的成分分析發現，牛蒡根中僅含有極少量的牛蒡子苷，表明還有其他有效成分發揮了抗腫瘤作用。為此，筆者對牛蒡根中抗腫瘤活性較強的氯仿提取物進行分離提取，采用體外篩選的方法明確其活性組分，進一步從細胞周期、凋亡、免疫功能和逆轉耐藥等方面探討其可能的抗腫瘤機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器 CO2孵育箱（美國Revco公司）；Infinite M200 PRO型全波長多功能酶標儀 (奧地利Tecan公司)；CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；96孔板（德國Greinerbio公司）；流式細胞分選儀 S3e（Bio-Rad Laboratories公司）；流式細胞儀（FACSCantoⅡ）。

1.1.2 試劑 牛蒡根為市售品；RPMI1640培養液（GIBCO公司）；小牛血清（CORNING 公司）；MTT、刀豆蛋白（北京欣經科生物技術有限公司）；石油醚、乙醚（天津市化學試劑三廠）；碘化丙啶PI（索萊寶科技有限公司）；RNase A（索萊寶科技有限公司）。

1.1.3 細胞株 小鼠骨肉瘤細胞S180、人白血病細胞K562、耐阿霉素人白血病細胞K562/O2均由天津市醫藥科學研究所腫瘤藥理室傳代保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備

1.2.1.1 溶劑提取法制備氯仿提取物：取市購新鮮牛蒡根（Arctiumlappa L.）（經天津中醫藥大學馬琳教授鑒定為真品），切制成片，干燥后粉碎。用8倍量的乙醇滲漉法提取，過濾。濾液減壓濃縮后的醇浸膏，加水使混懸。用氯仿萃取后，減壓回收溶劑，得氯仿層提取物。

1.2.1.2 硅膠柱層析法分離不同組分：取100～200目硅膠，玻璃管柱干法裝柱，敲打均勻，靜置過夜。氯仿層提取物浸膏3 g用氯仿溶解后加入硅膠攪拌均勻，放置過夜，氯仿自然揮干。次日裝柱，將攪拌均勻的樣品鋪于玻璃柱硅膠表面上端平面。加注洗脫液，依次為石油醚-乙醚（40∶1）、（25∶1）、（8∶1）和（3∶1），每種比例洗脫液500 mL。洗脫液沿柱內壁緩慢加入，經柱分離后的洗脫液依次用10 mL試管盛裝。取各試管樣品10 μL，點樣于活化后的硅膠薄層板底邊8 mm處，以氯仿-甲醇（9：1）展開。待展開8 cm后取出，揮干溶劑，噴以磷鉬酸顯色劑，105℃加熱至顯色清晰。選取斑點集中的合并，減壓回收溶劑，將濃縮物再低溫真空干燥后，稱重計算收率。

1.2.2 各組分成分初步鑒定

1.2.2.1 化學法鑒定組分成分：取4個組分樣品，用適量醋酐溶解，沿試管壁加入濃硫酸數滴，觀察在兩液交界處顯色反應（Liebermann-Burchard實驗）或滴入碘化鉍鉀沉淀試劑，觀察試管內是否有橘紅色沉淀產生（碘化鉍鉀沉淀實驗）。

1.2.2.2 TLC法鑒定組分成分：取活化后的硅膠薄層板，將待鑒定的L-1、L-2、β-谷甾醇和齊墩果酸標準品分別用氯仿溶解，各取10 μL，點樣于距薄層板底邊8 mm處。以石油醚-乙酸乙酯（1∶1）展開。待展開8 cm后取出，揮干溶劑，噴以磷鉬酸顯色劑，105℃加熱至顯色清晰。

1.2.3 樣品對體外培養腫瘤細胞生長的影響 取接種腫瘤細胞6~8 d生長良好的S180荷瘤小鼠，無菌條件下抽取腹水，PBS洗滌2次。用含10%小牛血清的RPMI1640液調整細胞濃度至1×106/mL單細胞懸液。另取對數生長期K562細胞，用10%小牛血清的RPMI1640液調整細胞濃度1×105/mL。兩種細胞分別以每孔100 μL分別接種于96孔板中。空白對照組加常規培養液，待測樣品組加入含相應濃度的有效組分溶液，使反應體系為200 μL。每組平行4孔。37℃、5%CO2培養箱中培養72 h后，離心，小心棄去上清，每孔加入 MTT（0.5 g/L）100 μL，繼續培養4h棄去上清，每孔再加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，用微量振蕩器振蕩10 min使結晶物充分溶解。以酶標儀于570 nm波長下檢測每孔的光密度（OD）值，按下式計算細胞生長抑制率。生長抑制率（IR，%）=（1-實驗組 OD/空白對照組 OD）×100%。細胞抑制率對劑量對數做線性回歸方程計算IC50值。

1.2.4 流式細胞術測定有效組分對K562細胞周期及凋亡的影響 取對數生長期K562細胞，用含10%小牛血清的RPMI1640液調整細胞接種于25 cm2培養瓶中。空白對照組加常規培養液，待測樣品組加含有一定濃度有效組分溶液，于37℃、5%CO2培養箱中培養72 h。取各組細胞用冷PBS洗滌2次，離心，用70%的乙醇溶液，4℃固定24 h，PBS洗滌 2 次后，加 RNaseA，終濃度為 50 μg/mL，37℃孵育30 min，加入 PI，終濃度為 20 μg/mL，避光，37℃孵育30 min，流式細胞儀分析細胞周期。另取對照組和待測樣品組細胞，分別加PBS緩沖液將細胞吹懸，加入試劑盒配套的1×binding buffer緩沖液中，用膜聯蛋白V（Annexin V）與PI染料避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5 樣品對淋巴細胞增殖的影響 昆明種小鼠頸椎脫臼處死，無菌條件下取出脾臟。用1 mL注射器吸取冷RPMI1640液，將小鼠脾淋巴細胞透過脾臟包膜沖出。收集脾淋巴細胞，調整細胞濃度至4×106/mL。以每孔75 μL加于96孔板中，再加入20 μg/mL的ConA溶液25 μL。設置空白對照組、ConA對照組和待測樣品組，每組平行4孔。空白對照組和ConA對照組加常規培養液，待測樣品組加入含相應濃度的有效組分溶液，使反應體系為200 μL。于 37℃、5%CO2培養箱中培養 72 h。用 MTT法（1.2.3項下步驟）在570 nm檢測OD值。

1.2.6 MTT法檢測樣品對K562/O2細胞耐藥性的影響

1.2.6.1 樣品對K562/O2細胞增殖能力的影響：取對數生長期K562/O2細胞，用10%小牛血清的RPMI1640液調整細胞濃度1×105/mL，以每孔100 μL接種于96孔板中。空白對照組加常規培養液，待測樣品組加入含相應濃度的有效組分溶液100 μL，每組平行4孔。37℃、5%CO2培養箱中培養72 h后，用MTT法（1.2.3項下步驟）在570 nm檢測OD值。

1.2.6.2 樣品對K562/O2細胞耐藥性的影響：取對數生長期K562/O2細胞，以1×105/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，再加入不同濃度的阿霉素溶液及一定濃度的樣品溶液各50 μL。平行設4個復孔，培養板37℃、5%CO2培養箱中培養72 h。用MTT法（1.2.3項下步驟）在570 nm檢測OD值，計算細胞抑制率及IC50。同時，測定阿霉素對K562細胞的IC50，用于計算耐藥倍數（耐藥指數=耐藥細胞IC50/敏感細胞 IC50）。

2 結果

2.1 樣品的制備 800 g牛蒡根粉末，經乙醇滲漉提取的浸膏，用氯仿萃取得提取物17.6 g。取3 g浸膏經硅膠柱洗脫分離后得到L-1、L-2、L-3和L-4，分別為 75.624、64.134、97.064 和 310.661 mg。各部分收率分別為0.055%、0.047%、0.007%和0.228%。其中組分L-1為淡黃色黏稠液體、組分L-2為白色固體、組分L-3和L-4均為褐色固體。

2.2 各組分成分初步鑒定

2.2.1 化學法鑒定組分成分 Liebermann-Burchard反應中，在兩液交界處，L-1最終顯暗綠色，L-2顯紫紅色環，組分L-3和L-4顯色不明顯。表明L-1主要成分可能含有甾體類成分，而L-2顯紫紅色環則可能含有三萜類成分。各組分的碘化鉍鉀沉淀反應實驗未見明顯的橘紅色沉淀，初步判定各組分中不含生物堿成分。

2.2.2 TLC法鑒定組分成分 在L-1和L-2色譜中，分別與β-谷甾醇和齊墩果酸對照品色譜相應位置上顯示相同的斑點，表明L-1組分中可能含有β-谷甾醇成分，而L-2組分中可能有齊墩果酸成分，見圖1。

圖1 牛蒡根氯仿提取物組分TLC及成分鑒定結果Fig 1 TLC chromatogram and identification results of chloroform extract from the roots of Arctiumlappa

表1 牛蒡根分離物對S180細胞毒作用結果Tab 1 Cytotoxicity of chloroform extract from the roots of Arctiumlappa in S180 cells

2.3 樣品對體外培養腫瘤細胞生長的影響 與細胞對照組相比，牛蒡根提取物甾體類組分（L-1）、三萜類組分（L-2）、L-3和L-4對小鼠S180細胞抑制活性都較強，在一定濃度范圍內基本上保持明確的量效關系，見表1。表2結果顯示，在19.53～625.00 μg/mL濃度范圍內4個組分對K562細胞增殖的抑制率有明顯不同，其中三萜類組分IC50最低，在此濃度范圍內存在明確的量效關系，較其他樣品效果最好。

表2 牛蒡根分離物對K562細胞毒作用的結果Tab 2 Cytotoxicity of chloroform extract from the root of Arctiumlappa in K562 cells

2.4 流式細胞術測定有效組分對K562細胞周期及凋亡的影響 與正常對照組相比，牛蒡根甾體類組分（250 μg/mL）并沒有對K562細胞周期產生明顯影響。而三萜類組分（100 μg/mL）可使K562細胞 G0/G1期細胞比例顯著增加，S期細胞比例顯著減少（P＜0.05）。對照組、甾體類組分及三萜類組分凋亡率分別為：（5.1±0.3）%、（21.8±2.4）%和 （38.0±2.8）%。與對照組相比，兩組分均明顯誘導K562細胞凋亡（均P＜0.05），見圖 2和表 3。

圖2 牛蒡根甾體類組分及三萜類組分對K562細胞周期和凋亡的影響Fig 2 The effect of Steroidal components and Triperpenoids components on cells cycle and apoptosis of K562 cells

表3 牛蒡根提取物有效組分對K562細胞周期及凋亡的影響Tab 3 The effect of Steroidal components and Triperpenoids components on cells cycle and apoptosis of K562 cells

2.5 樣品對淋巴細胞增殖的影響 從表4來看，ConA在體外能明顯促進小鼠脾淋巴細胞的增殖。牛蒡根三萜類組分在6.25～200 μg/mL時有促進細胞增殖的趨勢，但總體均沒有劑量依賴關系。甾體類組分在所測試的濃度范圍內對小鼠脾淋巴細胞大多表現出抑制增殖的作用。

2.6 MTT法檢測樣品對K562/O2細胞耐藥性的影響

2.6.1 樣品對K562/O2細胞增殖能力的影響 由表5結果看出，測試的最高濃度基本上未達到50%抑制率，說明有效組分對耐阿霉素細胞株K562/O2的細胞毒作用較弱。

表5 牛蒡根有效組分對K562/O2細胞毒作用結果Tab 5 Cytotoxicity of Steroidal components and Triperpenoids components in K562/O2 cells

2.6.2 樣品對K562/O2細胞耐藥性的影響 表6結果顯示，阿霉素對K562細胞的IC50值為0.052μg/mL，而阿霉素單獨作用于K562/O2細胞的IC50值為60.60 μg/mL，其耐藥指數超過 1 000。500μg/mL 或1 000 μg/mL的三萜類組分與阿霉素合用后，其IC50值仍高于阿霉素單獨使用時的IC50值。而甾體類組分與阿霉素合用后，在500 μg/mL時IC50值為48.79 μg/mL，在 1 000μg/mL 時 IC50值為 24.35 μg/mL，均比阿霉素單獨使用的IC50值低，耐藥指數均有降低，證明甾體組分有一定的逆轉細胞耐藥的趨勢。

表6 牛蒡根有效組分對K562/O2細胞逆轉耐藥作用結果Tab 6 The effect of Steroidal components and Triperpenoids components on reversing tumor multidrug resistance

3 討論

以往的實驗中，通過薄層色譜法對牛蒡根及牛蒡子化學成分進行了一些初步的比較，結果顯示，牛蒡根中幾乎不含有牛蒡子特有的抗腫瘤活性成分——牛蒡子苷。說明牛蒡根存在不同于牛蒡子苷的抗腫瘤活性成分，對其粗提物進一步分離提取，為研究其確切的抗腫瘤活性成分提供了依據。牛蒡作為菊科植物，從宏觀上來講，應該含有本科植物中普遍含有的聚炔類化合物、倍半萜內酯、三萜、黃酮、甾體、菊淀粉等成分[8-9]。本研究通過化學鑒定及活性測試，發現牛蒡根中活性物質可能是甾體類和三萜類成分。

選用S180細胞和K562細胞觀察牛蒡根氯仿層提取物進一步分離得到的甾體類組分、三萜類組分、L-3和L-4 4個組分的細胞毒活性。發現甾體類組分和三萜類組分活性較強且存在一定的量效關系。進一步研究發現，三萜類組分能夠使K562細胞阻滯在G0/G1期而不能進入DNA合成期（S期），抑制了腫瘤細胞DNA的合成。甾體類組分和三萜類組分都能明顯的引起K562細胞的凋亡。而引起細胞凋亡的機制很多，包括死亡受體途徑、線粒體途徑及交織旁路途徑等[10]。磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號通路是人類癌癥中一條重要的信號轉導通路，在大多數癌癥中都處于激活狀態，研究表明三萜類成分會下調PI3K-Akt信號通路，誘導細胞凋亡[11]。這也可能是牛蒡根三萜類組分誘導凋亡的途徑之一。另有研究發現，β-谷甾醇和腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體結合發揮誘導凋亡作用[12]。由此推斷牛蒡根有效組分的誘導凋亡機制與這兩個途徑相關。

腫瘤與免疫有著密不可分的關系，現代免疫學理論認為,腫瘤免疫以細胞免疫為主，機體抗腫瘤免疫反應中的細胞免疫主要依賴 T淋巴細胞介導[13]。脾臟屬于外周免疫器官，其中存在大量T淋巴細胞[14]。小鼠淋轉實驗顯示，三萜類組分在一些劑量下表現出一定的促進淋巴細胞增長的趨勢，能增強機體免疫功能，對抗腫瘤起到積極作用。腫瘤細胞的耐藥性是腫瘤化療失敗的主要原因，也是困擾腫瘤治療的一大難題[15]。化療耐藥涉及了藥物轉運蛋白、細胞凋亡抑制、DNA損傷修復和上皮-間充質轉化在內的多種因素[16]。MDR1基因過度表達產生的P-gp增加藥物轉運和外排是耐藥現象產生的最重要原因[17]。阿霉素可誘導某些細胞過表達P-gp，同時激活Wnt/β-catenin通路也可過表達P-gp，從而促進細胞對阿霉素耐藥[18]。甾體類組分表現出一定的逆轉K562/O2細胞的耐藥作用，其機制可能與降低P-gp表達相關，這個結果也將成為今后研究的重點。

牛蒡根是一個具有開發前景和研究價值的保健食品，本研究對牛蒡資源的再利用及天然來源新型抗腫瘤物質的發現具有十分重要的意義。本研究項目的完成將為科學地綜合利用牛蒡資源及天然來源新型抗腫瘤物質的發現打下良好的基礎。