長期秸稈還田與施肥對潮土酶活性和真菌群落的影響

李月，張水清，韓燕來，李世瑩，王祎，李慧，李芳*，譚金芳

1. 河南農業大學資源與環境學院，河南 鄭州 450002；2. 河南省農業科學院植物營養與資源環境研究所，河南 鄭州 450002；3. 中山大學農學院，廣東 廣州 510000

秸稈富含有機質及各種營養元素，是重要的有機肥資源之一（Zhang et al.，2014），秸稈還田在中國乃至全球農業生產中應用廣泛（Xu et al.，2018；Dhaliwal et al.，2020）。石含之等（2020）的研究表明，秸稈還田有助于優化土壤結構、提高土壤肥力。Bai et al.（2019）對中國典型的稻麥輪作農田和Li et al.（2019a）對中國西北地區的玉米長期連作試驗發現，秸稈還田均提高了土壤有機碳和全氮的含量。還田秸稈在土壤中的分解轉化過程是在土壤微生物的推動作用下進行的。土壤微生物是地球化學元素循環過程的重要推動力，其群落結構及多樣性已經成為判斷土壤質量狀況的重要依據（Veresa et al.，2015；Hartmana et al.，2008）。秸稈還田為土壤微生物的生長和繁殖提供了適宜的碳源和氮源，顯著增加了土壤中可利用碳源的含量及碳源種類的多樣性（Hao et al.，2019；Su et al.，2019）。秸稈還田勢必對土壤微生物群落結構有一定的重塑作用，本課題組前期研究顯示，長期秸稈還田改變了華北平原壤質潮土細菌的群落結構，促進了參與復雜有機物質降解的細菌豐度的增加（Li et al.，2017）。然而對其中真菌群落變化規律的認識還不夠充分。

土壤真菌對有機物料的降解和腐殖化具有重要影響（Chen et al.，2014）。有機碳含量高的農田土壤其真菌多樣性亦較高（Li et al.，2015；Williams et al.，2013）。真菌通過分泌高效的水解酶對秸稈進行分解轉化，這些酶亦被沉積到土壤中成為土壤酶的一部分（Chapla et al.，2012）。土壤中物質能量循環是各種復雜的酶促反應推動的，土壤酶是連接土壤微生物和土壤化學過程的重要媒介（Burns et al.，2013）。相對于整個微生物群落，土壤酶活性與特殊真菌群落的關系更加密切（Ling et al.，2014）。纖維素酶、木聚糖酶和β-1, 4糖苷酶是纖維素和半纖維降解過程中的關鍵水解酶，可將結構復雜的纖維素徹底降解為葡萄糖（Zhang et al.，2006）。堿性木聚糖酶可將木聚糖催化水解成木糖，從而促進秸稈降解（Beg et al.，2001）。秸稈中木質素的降解主要是氧化過程，該過程中的關鍵酶包括多酚氧化酶、過氧化物酶和脫氫酶，其中多酚氧化酶和過氧化物酶也是土壤腐殖質形成的關鍵酶（Burns et al.，2013）。土壤酶活性受不同施肥措施的顯著影響（李芳等，2015）。基于這幾種酶在秸稈降解、土壤腐殖質形成過程中的重要作用，我們通過長期定位施肥試驗分析其活性變化規律，深入探究了土壤碳循環相關酶活性與真菌群落結構間的關系。

麥玉輪作是中國黃淮海平原潮土區作物的主要輪作方式，長期秸稈還田對麥玉輪作農田土壤理化性狀及真菌群落結構產生了深刻的影響。然而，不同施肥處理下，真菌群落結構如何變化以及變化后對農田生態環境的意義并不十分清楚。因此，本研究基于黃淮海平原潮土區長期定位試驗，對不同施肥處理下土壤理化性質進行調查，并運用 Miseq高通量測序技術對土壤真菌群落結構進行解析。通過對應典范分析來解析不同施肥處理下土壤真菌群落結構的分異，采用蒙特分析揭示土壤真菌群落結構變化的主要驅動因子。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

土壤樣品采自國家潮土土壤肥力和肥料效益長期監測站，該站1990年建于河南省鄭州市，該地區以暖溫帶氣候為主，年平均氣溫約為14.4 ℃，年降水量約 640.9 mm。種植制度為小麥-玉米輪作。試驗地建立時，土壤pH為8.10，土壤有機碳10.60 g·kg-1，全氮 0.64 g·kg-1，速效磷 9.0 mg·kg-1，堿解氮76.6 mg·kg-1（張水清等，2017）。土壤類型為石灰性沖積土（Li et al.，2017）。

1.2 實驗設計和樣品采集

本研究涉及 3個處理，（1）單施化肥處理（NPK）：玉米季施肥量為 N 188 kg·hm-2、P2O594 kg·hm-2、K2O 94 kg·hm-2，磷鉀肥全部作為基肥施入，氮肥按基肥?追肥=1?1施入，灌漿期追肥；小麥季施肥量為 N 165 kg·hm-2、P2O582.5 kg·hm-2、K2O 82.5 kg·hm-2，其中磷鉀肥全部作為基肥施入，氮肥按基肥?追肥=1?1施入，于返青期追肥，小麥和玉米秸稈均移除。（2）秸稈還田配施化肥處理（SNPK）：2004年前小麥季氮肥70%由玉米秸稈提供，返青期用尿素補充30%的氮，2004年及以后秸稈還田提供50%的氮，返青期用尿素補充50%的氮，總施氮量165 kg·hm-2。磷鉀肥施用量與單施化肥處理施用量保持一致。玉米季施肥與NPK處理一致。（3）對照處理（CK）：不施用任何肥料，正常耕作，小麥和玉米秸稈均移除。小區面積為40 m2，設置3個重復。所用氮肥為含氮量45%的尿素；磷肥為含P2O512.05%的過磷酸鈣；鉀肥為含K2O 60%的氯化鉀。

2018年玉米收獲后，用五點取樣法采集各處理0—20 cm的新鮮土壤。在去除土壤中的石塊、植物根系等雜質后，土壤樣品過2 mm篩，混勻。之后分3部分保存：一部分室溫風干用于測定土壤基本理化性質；一部分 4 ℃保存用于測定土壤酶活性，最后一部分-80 ℃保存用于測定土壤真菌群落結構。

1.3 測定方法

pH 在水（無二氧化碳去離子水）土比 2.5?1（V:m）液中，用sartorious PB-10pH計（賽多利斯）測定；有機碳（Soil Organic Carbon，SOC）采用K2Cr2O7外加熱法測定；全氮（Total Nitrogen，TN）采用凱氏定氮法進行測定；速效磷（Available Phosphorus，AP）采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定；銨態氮（NH4+-N）采用靛酚藍比色法測定（鮑士旦，2000）；土壤硝態氮（NO3--N）采用雙波長分光光度法測定（涂常青等，2006）。

土壤酶活性的測定方法及單位定義見表 1。其中BAX、POD、PPO和β-GC用蘇州科銘公司對應的試劑盒進行測定。

土壤真菌群落測定：采用FastDNA Spin Kit for Soil（MP公司）進行土壤DNA提取，稱取0.5—0.6 g保存于-80 ℃的土壤樣品，按照試劑盒的操作步驟進行提取。得到的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進行完整性及純度檢測，采用 NANODROP ND-1000 V3.7.1進行DNA的濃度測定，高質量的DNA采用 ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）/ITS2（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）（Ghannoum，2010）引物對ITS1區進行PCR擴增。PCR反應體系（50 μL）：2×HiFi Hot Start Ready Mix 25 μL，引物（10 μmol·L-1）各 1 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 22 μL。PCR 反應程序：94 ℃·5 min，94 ℃·30 s，55 ℃·30 s，72 ℃ 30·s，28 個循環；72 ℃·10 min。使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物，Tris-HCl洗脫后，用1%瓊脂糖電泳檢測。得到的PCR產物進行等摩爾濃度混樣之后建庫，在 Illumina MiSeq測序平臺上進行雙端測序。下機序列進行去除barcode和primer優化，利用Trimmomatic軟件對原始序列進行質控，去掉錯配率過高（＞0.2）和質量較低（質量值＜20）的序列，最小保留序列長度為200 bp（Caporaso et al.，2010）；用 Flash 軟件對序列進行拼接，設置最小overlap為10 bp，允許最大錯配率為 0.2，得到 Fasta序列（Mago? et al.，2011）。去除 clean-tags中的重復序列后，將序列相似度≥97%的序列歸為一個 OTU 并進行統計（Edgar，2013；Torbj?rn et al.，2016）。運用真菌 ITS 數據庫Unite（http://unite.ut.ee/index.php）對代表性OTU進行分類注釋，便于下游分析。測序結果已上傳至NCBI SRA數據庫，接收編號為：PRJNA592885。

表1 土壤酶活性測定方法及酶活性定義Table 1 Determination of soil enzyme activity and its definition

1.4 數據處理

采用IBM SPSS Statistics 26進行單因素方差分析（ANOVA），對不同真菌屬豐度與土壤理化性質之間進行Spearman相關分析。使用R軟件vegan包進行典范對應分析（CCA）和蒙特分析，采用Graphpad 8.0進行圖片的可視化。

2 結果與分析

2.1 長期不同施肥處理下土壤化學性質變化

與對照相比，單施化肥處理和秸稈還田處理均引起土壤pH的顯著下降（表2）。與不施肥對照相比，秸稈還田配施化肥處理顯著提高了SOC含量，增幅達45.21%；單施化肥處理的SOC含量與對照相比無顯著差異。單施化肥和秸稈還田配施化肥處理均顯著提高了土壤TN、NO3--N和AP含量；秸稈還田配施化肥處理增幅較大，分別為 91.11%、16.98%和182.75%。土壤NH4+-N含量在各處理間差異不顯著。

2.2 長期不同施肥處理下土壤酶活性變化

與對照相比，單施化肥處理顯著增加了PPO活性，增幅為41.39%，秸稈還田條件下該酶活性無顯著變化（表3）。秸稈還田配施化肥顯著提高了土壤POD活性，增幅為80.89%。與對照相比，秸稈還田配施化肥處理中β-GC活性增加了20.06%，而單施化肥處理中其活性降低了24.08%。單施化肥與秸稈還田處理均顯著增加了土壤CL活性，增幅分別為53.66%和60.16%。土壤BAX活性在各處理間無顯著變化。

表2 不同處理下土壤化學性質Table 2 Chemical properties of soils in different treatments

表3 不同處理下土壤碳循環相關酶活性Table 3 Soil carbon cycling related enzymes activity in different treatments

2.3 長期不同施肥處理下土壤真菌群落結構變化

Miseq高通量測序共得到 615217條序列，按最小樣本數進行抽平行后展開分析，每個樣品保留序列數為29659。與對照相比，Ace指數和Chao指數在秸稈還田配施化肥處理下顯著增加，表明秸稈還田配施化肥處理顯著提高了土壤真菌 α-多樣性（圖1）。

真菌群落主要包括子囊菌門（30.32%—84.23%）、擔子菌門（2.27%%—66.27%）、接合菌門（1.20%—4.17%）、壺菌門（0.005%—0.30%）、球囊菌門（0.35%—1.57%）和Rozellomycota（0.03%—0.96%）。典范對應分析（圖2）顯示，長期單施化肥、秸稈還田配施化肥處理中潮土真菌群落結構與對照相比出現明顯分異。結合蒙特分析結果（表4），引起不同施肥處理下真菌群落結構分異的主要影響因子是POD、β-GC、SOC以及TN。對主要的真菌（屬水平）進行統計分析，發現9個真菌屬在不同處理間呈現顯著性變化（圖3）。與對照相比，長期秸稈還田處理中彎孢菌屬（Curvularia）、籃狀菌屬（Talaromyces）、赤霉菌屬（Gibberella）、鐮刀菌屬（Fusarium）、被孢霉屬（Mortierella）、毛殼屬（Cheatomium）以及枝頂孢屬（Acremonium）真菌相對豐度顯著增加，毛霉屬（Piloderma）和口蘑屬（Tricholoma）真菌相對豐度顯著下降。與對照相比，單施化肥處理中枝頂孢屬（Acremonium）真菌相對豐度顯著降低。

圖1 不同處理下土壤真菌群落α-多樣性指數Fig. 1 α-diversity index of soil fungal community under different treatments

圖2 典范對應分析展示真菌群落分異及其主導性因子Fig. 2 Fungal community differentiation and its driving factors revealed by canonical correspondence analysis

表4 蒙特分析展示土壤真菌群落相關的生物化學性質Table 4 The biochemical factors that correlated with fungi communities based on Mantel tests

2.4 真菌優勢屬豐度與土壤化學性質和酶活性的相關性分析

圖3 不同處理間豐度顯著變化的真菌（屬水平）Fig. 3 Fungal genus with significant changes in different treatments

圖4 土壤真菌相對豐度與環境因子相關性分析Fig. 4 Correlation analysis of soil fungal relative abundance and environmental factors

通過 Spearman相關分析解析真菌群落組成與土壤生物化學性質之間的關系（圖4）。其中枝頂孢屬（Acremonium）、鐮刀菌屬（Fusarium）、曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）、籃狀菌屬（Talaromyces）、彎孢菌屬（Curvularia）均與土壤β-GC活性顯著正相關，而口蘑屬（Tricholoma）真菌與β-GC顯著負相關；毛霉屬（Piloderma）、鏈格孢屬（Alternaria）與POD活性顯著負相關；鐮刀菌屬（Fusarium）、赤霉菌屬（Gibberella）、籃狀菌屬（Talaromyces）、木霉屬（Trichoderma）與 NO3--N極顯著正相關（P＜0.01），鏈格孢屬（Alternaria）與NO3--N顯著正相關；鐮刀菌屬（Fusarium）、赤霉菌屬（Gibberella）、籃狀菌屬（Talaromyces）、木霉屬（Trichoderma）與 TN顯著正相關；鏈格孢屬（Alternaria）、籃狀菌屬（Talaromyces）、口蘑屬（Tricholoma）與 SOC顯著正相關，赤霉菌屬（Gibberella）與 SOC極顯著正相關（P＜0.01），而毛霉屬（Piloderma）則與SOC顯著負相關。

3 討論

與不施肥對照相比，28年的秸稈還田配施化肥顯著提高了土壤SOC、TN含量，這與國內其他長期試驗地的研究結果一致（Ye et al.，2019；Li et al.，2019b）。Liu et al.（2019）研究發現，秸稈來源養分的持續加入激發了土壤微生物的活性，微生物量的增加促進了秸稈碳在土壤中的累積（Liu et al.，2019）。本研究中，單施化肥處理TN含量與對照相比增加了13.54%，達到顯著水平，但SOC的增加不顯著。化肥的添加促進植物生長，最終增加土壤碳輸入，然而這種增加可能被土壤碳礦化速率的增加所抵消。長期氮肥輸入促進了輕組有機碳的礦化，卻使重組有機碳更加穩定，整體上化肥添加對土壤有機碳總量的影響存在很大變異性（Neff et al.，2002）。

土壤β-GC、CL、POD酶活性在長期秸稈還田條件下顯著上升。其中β-GC是細胞結合型胞外酶，屬于纖維素酶的一種，被微生物分泌到胞外后，需要與細胞結合才能發揮作用，其活性與產酶真菌關系密切（Richard et al.，2013）。枝頂孢屬（Acremonium）、鐮刀菌屬(Fusarium)、青霉屬（Penicillium）、籃狀菌屬（Talaromyces）等均被證明具有較高的纖維素酶分泌能力（Manglekar et al.，2020）。結合本研究結果，枝頂孢屬（Acremonium）、鐮刀菌屬(Fusarium)、青霉屬（Penicillium）、籃狀菌屬（Talaromyces）、彎孢菌屬（Curvularia）真菌可能共同貢獻了土壤中β-GC、CL酶活性的上升。POD是一種氧化型含鐵木質素降解酶，具有很高的還原力，使用H2O2作為電子受體，其主要在秸稈降解的后期發揮關鍵作用（Wen et al.，2019）。POD酶同時參與芳香性有機物的降解和腐殖化過程，其作用機理非常復雜。許多擔子菌門真菌具有大量編碼胞內和胞外木質素酶的基因，同時大量細菌亦可產生POD酶（Richard et al.，2013）。本研究中，POD酶活性與鏈格孢屬（Alternaria）、毛霉屬（Piloderma）真菌豐度顯著負相關，與曲霉屬（Aspergillus）、籃狀菌屬（Talaromyces）正相關但未達到顯著性，可能與細菌對POD酶的貢獻有關。

前人研究顯示，有機物料的添加可促進土壤微生物群落從快速生長的致病菌向慢速生長的有益菌方向轉化，最終提升了土壤中有益真菌的相對豐度（Yang et al.，2019）。本研究中，長期的秸稈添加引起了9個屬真菌豐度的顯著性變化。其中絕大部分真菌具有很強的秸稈降解能力。例如枝頂孢屬（Acremonium）真菌可以合成分泌胞外 1, 6-β-葡聚糖酶和1, 3-β-葡聚糖酶，對秸稈進行高效降解（Li et al.，2019c； Jayus et al.，2002）；鐮刀菌屬（Fusarium）真菌可通過產生堿性木聚糖酶對秸稈進行有效降解（Ramanjaneyulu et al.，2017）。同時，青霉菌屬（Penicillium）真菌有很強的纖維素、半纖維降解能力，易被周期性加入的秸稈所激發（Singhvi et al.，2011）。被孢霉屬（Mortierella）和毛殼屬（Cheatomium）真菌受有機添加物質的強烈激發，它們亦被報道有一定的纖維素降解能力（Li et al.，2018）。總之，秸稈周期性的加入對纖維素降解真菌具有顯著地刺激作用。

秸稈周期性加入激發的真菌對土壤生態環境意義重大。在長期秸稈還田條件下鐮刀菌屬（Fusarium）真菌豐度的顯著增加已經被前人報道（Wicklow et al.，2005），盡管該屬真菌常被認為是禾本科作物的致病菌（Cobo-Diaz et al.，2019），亦有研究證明部分鐮刀菌對預防作物土傳病原真菌有良好的效果（Kavroulakis et al.，2007）。枝頂孢屬（Acremonium）可在玉米根系內定植，其合成的抗生素Pyrrocidine A和Pyrrocidine B能夠有效抑制黃曲霉、立枯絲核菌和褐腐鐮刀菌等病原真菌的生長（Wicklow et al.，2005；Wicklow et al.，2009）。毛殼屬（Cheatomium）真菌產生的毛殼菌素對許多病原真菌有顯著的抑制作用，同時該屬真菌可促進作物生長、提高作物產量（Vasanthakumari et al.，2014）。青霉菌屬（Penicillium）真菌對多種植物病原菌均有一定的防治作用（Larena et al.，2003）。被孢霉屬（Mortierella）真菌可通過分泌草酸刺激多種類型土壤中磷的溶解，促進有效磷濃度的增加，在有機碳累積中亦發揮重要作用（Clemmensen et al.，2014；Nelson et al.，2014）。綜上，長期秸稈還田激發了秸稈降解真菌豐度的顯著提高，其中大部分是有益菌，它們廣泛參與土壤碳周轉和養分轉化，而小部分病原菌的致病性也可被有益菌分泌的抗生素所抑制。總體上，長期秸稈還田條件下真菌群落結構得到優化。

4 結論

長期秸稈還田配施化肥處理顯著提高了土壤SOC、TN和AP含量，提高了POD和CL的活性，促進土壤真菌群落結構的優化，顯著增加了彎孢菌屬（Curvularia）、籃狀菌屬（Talaromyces）、赤霉菌屬（Gibberella）、鐮刀菌屬（Fusarium）、被孢霉屬（Mortierella）、毛殼屬（Cheatomium）以及枝頂孢屬（Acremonium）的相對豐度，這些真菌豐度的增加對改良農田土壤生態環境意義重大。