初治彌漫大B細胞淋巴瘤患者hsa-miR-23a、hsa-miR-566表達水平及其臨床意義

陶盛能，張旭晗，張 睿，朱小玉，王小華

(1.安徽省蕪湖市第二人民醫院血液內科，安徽 蕪湖 241000；2.中國科學技術大學第一附屬醫院血液內科，安徽 合肥 230000；3.安徽醫科大學第四附屬醫院血液內科，安徽 合肥 230000)

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)在我國發病率占非霍奇金淋巴瘤患者的30%～40%[1-2]。該疾病無論是在組織形態學、臨床表現，還是預后均具有顯著的特異性。近年來DLBCL病理亞型及生物治療的相關科研均取得一定的進展，但仍有部分患者在接受DLBCL的一線藥物(如妥昔單抗、阿霉素、長春新堿、潑尼松龍、環磷酰胺)治療后的效果較差，且很快出現耐藥性，導致部分患者預后不佳[3-4]。在腫瘤miRNAs表達譜中，有研究證實hsa-miR-23a-3p可促進乳腺癌細胞復制增加并增加耐藥癌基因的表達[5]；在腎細胞癌中miR-566低表達患者生存期更長[6]。然而，關于外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表達水平與DLBCL患者臨床特征及預后生存期的關系研究尚未見報道。故本研究通過探究DLBCL患者外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表達水平及其臨床意義，旨以DLBCL的診治及預后研判提供一種新思路，現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年5月—2019年1月安徽省蕪湖市第二人民醫院收治的DLBCL患者作為研究對象。納入標準：①臨床資料完整，年齡>18歲；②符合中華醫學會血液學分會2013年制訂的DLBCL診斷標準[7]；③在取標本時，患者尚未經過任何治療；④患者均接受足夠療程的R-CHOP(R為利妥昔單克隆抗體，C為環磷酰胺，H為阿霉素，O為長春新堿，P為潑尼松)化療方案。排除標準：①心、腦、肺、肝、腎等器官功能嚴重損害者；②有長期進行激素藥物治療史者；③對化療藥物過敏者；④中途失訪或轉院治療者。符合上述納入和排除標準的患者共60例，并將其納入觀察組，男性36例，女性24例，年齡18～72歲，平均(55.78±8.93)歲。根據參照匹對原則，選取60例體檢健康者作為對照組，男性35例，女性25例，年齡18～71歲，平均(54.24±8.75)歲。觀察組與對照組的性別、年齡等差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有患者知情并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566指標檢測 于治療前抽取DLBCL患者空腹靜脈血5 mL，同時收集健康者體檢時的靜脈血，3 000 r/min離心10 min后，分離血清,收集上層清液進行檢測。采用賽默飛世爾科技(中國)有限公司的miRNA Vana PARIS試劑盒，按照說明書對血清的總RNA進行提取。采用賽默飛世爾科技(中國)有限公司的TaqMan miRNA試劑盒進行逆轉錄反應。hsa-miR-23a-3p上游引物：5′-ATCCAGTAA-GGACTG-3′； hsa-miR-23a-3p下游引物：5′-CGAATCAGGACTCGTC-3′； hsa-miR-566上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATG-3′； hsa-miR-566下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTT-GCGT-3′。完成逆轉錄反應。采用熒光定量PCR法檢測，以U6為內參，40個循環(95 ℃ 1 min、60 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min)延伸72 ℃(7 min)。每個標本均重復3次，取平均值。根據公式2-△△CT計算hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566的相對表達量。

1.2.2預后隨訪 對60 例DLBCL患者出院后通過電話、門診等多方式進行隨訪。預后定義，起點時間：DLBCL患者開始治療的時間；終點事件：包括DLBCL病情進展、死亡，或隨訪期間內出現失訪者；終點時間：存活，且能隨訪到的患者，以2019年11月30日為隨訪截止時間，失訪者以最后1次隨訪時間為終點時間，生存時間為終點時間減去起點時間。

1.3觀察指標 ①觀察血清hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566在初治DLBCL患者與健康人群的差異。②觀察血清hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566與DLBCL患者臨床特征[性別、年齡、腫瘤分期、淋巴結區受累數、國際預后指數(international prognostic index，IPI)、血清乳酸脫氫酶濃度(lactic dehydrogenase，LDH)]的關系。③觀察血清hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表達水平對DLBCL患者生存時間的影響。

1.4統計學方法 應用SPSS 17.0軟件分析數據。計量資料比較采用獨立樣本的t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗；生存分析采用 Kaplan-Meier法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1觀察組與對照組的外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表達水平比較 觀察組患者的外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表達水平均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 觀察組與對照組的hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表達水平比較Table 1 Comparison of expression levels of hsa-miR-23a-3p and hsa-miR-566 between the observation group and the control group

2.2外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表達水平與DLBCL患者臨床特征的關系 DLBCL患者的外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表達水平在不同年齡、性別、LDH指標組的表達差異無統計學意義(P均>0.05)，在不同腫瘤分型、淋巴結區受累數、IPI積分中的表達，差異有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表達水平與DLBCL患者的臨床特征關系Table 2 The relationship between the expression levels of hsa-miR-23a-3p and hsa-miR-566 in peripheral blood and the clinical characteristics of DLBCL patients

2.3外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表達水平對DLBCL患者生存時間的影響 至隨訪截止時間，60例DLBCL患者的隨訪時間為9～60個月，平均中位隨訪時間29.82個月，死亡28例，無病例失訪。分別以患者外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566表達水平均數3.35、1.69作為分割臨界值，將患者分為hsa-miR-23a-3p高表達組(32例)、hsa-miR-23a-3p低表達組(28例)；hsa-miR-566高表達組(29例)、hsa-miR-566低表達組(31例)。其中hsa-miR-23a-3p高表達組3年總生存率為40.63%(13/32)，明顯低于低表達組的67.86%(19/28)，差異有統計學意義(χ2=4.450，P=0.035)；hsa-miR-23a-3p高表達組、hsa-miR-23a-3p低表達組的中位生存時間分別為26.73個月和32.52個月(P<0.001)，見圖1。hsa-miR-566高表達組3年總生存率為37.93%(11/29)，明顯低于低表達組67.74%(21/31)，差異有統計學意義(χ2=5.350，P=0.021)；hsa-miR-566高表達組、hsa-miR-566低表達組的中位生存時間分別為27.45個月和32.35個月(P<0.001)，見圖2。

圖1 DLBCL患者外周血hsa-miR-23a-3p高表達與低表達的生存曲線

圖2 DLBCL患者外周血hsa-miR-566高表達與低表達的生存曲線

3 討 論

DLBCL是一類形態學、免疫分型及分子機制極為復雜的惡性淋巴瘤，導致目前臨床科研對DLBCL具體分型標志、發生機制及早期標志物的尋找仍存在較大盲區[8-9]。致使部分DLCBL患者的治療療效仍較差，且部分患者極易出現耐藥情況[10]，進而影響患者的生存期。導致這一因素可能與腫瘤細胞自我更新能力增強有關。而腫瘤細胞更新能力、凋亡受阻、分化能力障礙而致細胞停滯于發育的不同階段均涉及多種癌基因、抑癌基因及復雜的信號通路。因此，尋找與DLBCL相關基因標志物已成為臨床科研的重點。

以高度保守型的內源性非編碼微小分子RNA(microRNA，miRNA)廣泛涉及到生命的重要過程，如細胞增殖、代謝、遷移、分化等[11]。正常表達的miRNA 能夠調控細胞分化、增殖，但異常表達則可促進腫瘤發生、發展[12]。目前至少約有30個miRNA已被發現與DLBCL 的發生發展過程相關[13]。本研究發現DLBCL患者外周血hsa-miR-23a-3p表達水平均高于健康人群，且與DLBCL患者的腫瘤分期、淋巴結區受累數及IPI指數存在顯著相關。提示外周血hsa-miR-23a-3p表達水平可能參與DLBCL發生發展。hsa-miR-23a-3p屬于miR-23的亞型，參與細胞發育的各個階段，在結腸癌、肺癌等惡性腫瘤中呈高表達，屬于致癌基因。高表達的miR-hsa-23a可作為RUNX2靶點通過挽救受損細胞生長發揮致癌基因的作用[14]。RUNX2恰好是致癌轉錄因子RUNX家族成員，在癌變的發展過程中，可幫助受損的癌細胞增殖、遷移、侵襲[15]。因此hsa-miR-23a-3p表達上調還可反映腫瘤分期、淋巴結區受累情況。本研究還發現DLBCL患者外周血hsa-miR-23a-3p高表達組的3年總生存率、中位生存時間均低于低表達患者。這與Wang等[16]研究提到的hsa-miR-23a-3p高表達是DLBCL預后不良標志物的結論完全相符。因為hsa-miR-23a-3p表達上調不僅可通過靶向性抑制作用，發揮促進癌細胞增殖、轉移，加快其侵襲進程的作用。還可抑制編碼蛋白質的轉移抑制因子1[17]，促使腫瘤細胞快速轉移，進而影響患者預后。

抑制血管新生成一直被臨床認為是治療腫瘤的主要方向。在基因信息學預測提示中，VHL基因是hsa-miR-566的調控靶點，VHL(Von Hippel-Lindau)基因定位于 3p25～26 區，是一種重要的腫瘤抑制基因。hsa-miR-566表達上調可通過作用于VH基因L，從而影響血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達，而VEGF的表達水平被認為在DLBCL 發生發展中發揮重要作用[18]。因為VEGF可通過旁分泌在DLBCL中發揮生物學作用，如刺激血管內皮細胞促使其增殖形成新生血管[19]，提高癌細胞增殖活性，體現出癌變及惡性度的變化，從而影響患者預后。本研究發現DLBCL患者外周血hsa-miR-566高于健康人群，且與DLBCL患者的腫瘤分期、淋巴結區受累數及IPI指數存在顯著相關。說明外周血hsa-miR-566不僅參與DLBCL發生過程，可能還通過分子多層級聯介導DLBCL患者預后。在人類膠質母細胞瘤中，hsa-miR-566表達下調能促進VHL的表達[20]，而VHL是腫瘤抑制基因，其表達上調有利于患者病情轉歸。相反，當hsa-miR-566表達上調時，則不能很好的促進VHL表達，致使這種腫瘤抑制基因功能消弱，從而影響患者預后。孫鶴立等[21]研究也提到hsa-miR-566上調可能使DLBCL患者產生較差結局。本研究也發現DLBCL患者外周血hsa-miR-566高表達組的3年總生存率、中位生存時間均低于低表達患者，與上述結論相符。但目前關于hsa-miR-566表達水平與不同腫瘤的相關研究較少，其在DLBCL中的具體作用機制是通過何種通路調節靶基因的表達，尚有待進一步探索。

綜上所述，初治DLBCL患者的外周血hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-566均呈高表達，且與臨床分期、淋巴結區受累數、IPI指數及生存期存在密切聯系。兩項指標有望成為診斷DLBCL的重要標記物。