多囊蛋白在成釉細(xì)胞瘤的表達(dá)及分布研究

侯亞麗，楊 麗，劉 冰，張 昊，李向軍*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，口腔醫(yī)院病理科，河北省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，口腔醫(yī)院口腔頜面外科，河北省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050017；3.河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，口腔醫(yī)院牙周一科，河北省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050017)

多囊蛋白(polycystin,PC)作為一個(gè)細(xì)胞表面的膜受體，最早在常染色體顯性多囊性腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)的研究中被發(fā)現(xiàn)，其家族共有五個(gè)成員[1]。研究表明由PKD1基因(polycystic kidney disease 1,PKD1)和PKD2基因分別編碼的多囊蛋白1(polycystin-1,PC-1)和多囊蛋白2(polycystin-2,PC-2)與囊腫的形成有關(guān)[2-5]。而且PC-1和PC-2還與多個(gè)細(xì)胞信號(hào)存在相互作用，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生一定影響[6]。成釉細(xì)胞瘤是一種良性牙源性上皮性腫瘤，具有局部侵襲性和易復(fù)發(fā)的生物學(xué)特性。組織病理學(xué)分為實(shí)性/多囊型、單囊型、促結(jié)締組織增生型及骨外/周圍型成釉細(xì)胞瘤。PC-1和PC-2在成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)和分布如何？目前國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)PC-1和PC-2在成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)及分布，并與牙源性角化囊腫(odontogenic keratocyst，OKC)相比較，為研究成釉細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新的早期診斷和治療方法提供線索。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年2月—2019年6月河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科手術(shù)切除的成釉細(xì)胞瘤標(biāo)本30例(成釉細(xì)胞瘤組)；牙源性角化囊腫標(biāo)本15例(牙源性角化囊腫組)。成釉細(xì)胞瘤組男性19例，女性11例，年齡17～38歲，平均(26.6±6.9)歲；牙源性角化囊腫組，男性10例，女性5例，年齡16～47歲，平均(30.0±10.4)歲。標(biāo)本制作及切片染色在河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)(學(xué))院口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔科實(shí)驗(yàn)室完成。所有病例均由兩位高年資病理醫(yī)生進(jìn)行病理診斷并分型。成釉細(xì)胞瘤組中實(shí)性/多囊型成釉細(xì)胞瘤22例：其中濾泡型13例，叢狀型9例；單囊型成釉細(xì)胞瘤8例。以上所有病例術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療或生物治療并且均有完整的臨床病例資料并隨訪。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 PC-1和PC-2多克隆抗體購(gòu)自英國(guó) Abcam 公司,PV-9000免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-Diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 分別將成釉細(xì)胞瘤組和牙源性角化囊腫組標(biāo)本分切、固定，石蠟包埋，切成3～4 μm切片，常規(guī)脫蠟至水。磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗3 min×3次，放入枸櫞酸緩沖液進(jìn)行熱修復(fù)15～17 min，一抗PC-1和PC-2濃度分別為1∶75和1∶100。以后按PV9000試劑盒說(shuō)明書操作，DAB染色，蘇木素復(fù)染，酸酒精分化，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陽(yáng)性對(duì)照采用已知的陽(yáng)性組織切片，陰性對(duì)照用PBS代替一抗。

1.4結(jié)果判定 PC-1和PC-2陽(yáng)性為細(xì)胞漿或細(xì)胞膜有淡黃色或棕色顆粒沉積。根據(jù)染色強(qiáng)度和腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率評(píng)估免疫組織化學(xué)得分。選取腫瘤細(xì)胞染色陽(yáng)性密集區(qū)域，在高倍鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞的染色情況。染色強(qiáng)度評(píng)分如下：無(wú)著色=0分、淡黃色=1分、黃褐色=2分、棕褐色=3分。平均陽(yáng)性細(xì)胞百分率為：<5%為0分、5%～25%為1分、>25%～50%為2分、>50%為3分。細(xì)胞染色強(qiáng)度與平均陽(yáng)性細(xì)胞率的評(píng)分之和為PC-1與PC-2的免疫組織化學(xué)染色最終得分。將評(píng)分結(jié)果1分定為陰性、2分為弱陽(yáng)性，3分為陽(yáng)性，>4分為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)及四格表資料的Fisher確切概率法檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1PC-1與PC-2在成釉細(xì)胞瘤組和牙源性角化囊腫組中的表達(dá) 成釉細(xì)胞瘤組PC-1與PC-2主要表達(dá)于腫瘤的成釉細(xì)胞樣細(xì)胞及部分星網(wǎng)狀層樣細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜(圖1～2)，尤其濾泡型成釉細(xì)胞瘤上皮團(tuán)塊中央的腫瘤細(xì)胞發(fā)生鱗狀化生或囊性變時(shí)，鱗狀化生和囊腔周邊的細(xì)胞PC-1與PC-2呈強(qiáng)陽(yáng)性(圖3～4)；成釉細(xì)胞瘤中PC-2的表達(dá)強(qiáng)于PC-1。牙源性角化囊腫組PC-1與PC-2呈現(xiàn)弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)(圖5～6)，弱陽(yáng)性表達(dá)主要位于部分牙源性角化囊腫復(fù)層鱗狀上皮的棘層、粒層及部分基底細(xì)胞，并且纖維囊壁中子囊周邊細(xì)胞PC-1與PC-2呈陰性表達(dá)(圖7～8)。成釉細(xì)胞瘤組PC-1與PC-2的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于牙源性角化囊腫組(P<0.05)，見表1。

表1 PC-1與PC-2在成釉細(xì)胞瘤組和牙源性角化囊腫組中的表達(dá)Table 1 Expression of PC-1 and PC-2 in ameloblastoma and odontogenic keratocyst groups (例數(shù)，%)

2.2PC-1與PC-2在成釉細(xì)胞瘤組各病理亞型中的表達(dá) PC-1與PC-2在實(shí)性/多囊型和單囊型成釉細(xì)胞瘤(圖9～10)中分布和陽(yáng)性表達(dá)率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在實(shí)性/多囊型成釉細(xì)胞瘤病理亞型中，濾泡型和叢狀型成釉細(xì)胞瘤PC-1和PC-2的分布和陽(yáng)性表達(dá)率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2～3。

表2 PC-1與PC-2在實(shí)性/多囊型和單囊型成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá) Table 2 Expression of PC-1 and PC-2 in solid/multicystic and monocystic ameloblastoma (例數(shù)，%)

表3 PC-1與PC-2在實(shí)性/多囊型成釉細(xì)胞瘤各病理分型中的表達(dá) Table 3 Expression of PC-1 and PC-2 in solid/polycystic ameloblastoma (例數(shù)，%)

3 討 論

成釉細(xì)胞瘤是臨床常見的良性牙源性上皮腫瘤，但是由于早期無(wú)明顯臨床表現(xiàn)而不易被早期發(fā)現(xiàn)。患者就診時(shí)頜骨常常已有大范圍破壞，再加上其侵襲性的生長(zhǎng)方式，其治療只能手術(shù)切除部分頜骨。但是切除部分頜骨必將影響患者的面容及咬合關(guān)系，影響患者的生存質(zhì)量。因此，深入研究成釉細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，探索新的早期診斷和治療方法具有重要意義。

PC是一個(gè)受體樣的跨膜蛋白，其位于胞內(nèi)的羧基端含有3個(gè)潛在的酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，這提示該蛋白可能在細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)的傳遞中發(fā)揮作用。目前研究主要集中于PC-1和PC-2兩種多囊蛋白異構(gòu)體。PC-1主要分布于肝臟、腎臟、胰腺、腸、心臟等組織，可表達(dá)于上皮細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞；PC-2主要分布于腎臟、甲狀腺和血管組織中，而肝臟、胰腺、小腸、胃、脾臟、腦組織、食管中則未查及存在[5]。研究表明ADPKD中編碼2種PC的基因突變導(dǎo)致了液體充盈的腎囊腫以及其他上皮器官(包括肝臟和胰腺)的囊腫的產(chǎn)生[7-10]。成釉細(xì)胞瘤是口腔頜面部的一種良性牙源性上皮性腫瘤，在組織病理學(xué)上常有單個(gè)或多個(gè)囊腔的形成，但是目前并無(wú)研究報(bào)道PC是否與成釉細(xì)胞瘤的囊腔形成和局部浸潤(rùn)的生物學(xué)特性有關(guān)。故本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)PC-1與PC-2在成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)及分布，為研究其發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新的早期診斷標(biāo)記物和新的治療靶點(diǎn)提供線索。

長(zhǎng)期以來(lái)關(guān)于PC對(duì)多囊腎、多囊肝以及多囊卵巢的病變形成及發(fā)展機(jī)制方面學(xué)者們作了大量研究。研究發(fā)現(xiàn)，PC不僅可以通過(guò)多個(gè)信號(hào)通路如：cAMP、MAPK、Wnt、JAK-STAT、Hippo、Src和mTOR等[11-12]參與調(diào)控細(xì)胞的生物過(guò)程，如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖分化、遷移及囊腔的形成等[13-16]，而且還可以通過(guò)對(duì)mTOR通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖[17-18]。腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境可調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)使其性能改變重塑，進(jìn)而提高腫瘤細(xì)胞局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力[19]。研究已表明過(guò)度表達(dá)的PC-1與PC-2還能夠通過(guò)mTOR通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的局部浸潤(rùn)，并且過(guò)表達(dá)的PC-1與上皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)有關(guān)。有研究表明[20]，大腸癌細(xì)胞HCT116中PC-1與PC-2的過(guò)度表達(dá)可以促進(jìn)大腸癌的EMT進(jìn)程，從而在大腸癌的局部浸潤(rùn)/遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的過(guò)程中起到重要調(diào)節(jié)作用。目前，EMT在成釉細(xì)胞瘤生物學(xué)行為中的調(diào)控作用也得到了證實(shí)：Siar等[21]認(rèn)為EMT與成釉細(xì)胞瘤的局部浸潤(rùn)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，PC-1與PC-2在實(shí)性/多囊型AB各病理分型中均為明顯高表達(dá)，這提示PC-1與PC-2的高表達(dá)可能與成釉細(xì)胞瘤本身的腫瘤特性有關(guān)，PC可能參與成釉細(xì)胞瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，對(duì)其浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的生物學(xué)行為產(chǎn)生一定影響，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。課題組認(rèn)為，成釉細(xì)胞瘤與牙源性角化囊腫盡管在組織病理學(xué)上有一定相似性：①病變均有囊腔；②腫瘤中均含有細(xì)胞核極性倒置的成釉細(xì)胞樣細(xì)胞，但兩者本質(zhì)還是不同的。而且以往認(rèn)為成釉細(xì)胞瘤與牙源性角化囊性瘤均為牙源性上皮性腫瘤，但是2017年WHO對(duì)牙源性腫瘤重新進(jìn)行了分類，將“牙源性角化囊性瘤”改回了以前的“牙源性角化囊腫”的名稱，并將其劃入了囊腫章節(jié)，而成釉細(xì)胞瘤仍屬于牙源性腫瘤。PC-1與PC-2在大部分牙源性角化囊腫中呈現(xiàn)陰性表達(dá)，僅有少量為弱陽(yáng)性表達(dá)，這明顯不同于成釉細(xì)胞瘤中的高表達(dá)。此結(jié)果提示PC-1與PC-2可能與牙源性角化囊腫的形成無(wú)明顯關(guān)系。此前，研究者曾發(fā)現(xiàn)PC-1在含牙囊腫所有上皮細(xì)胞均有表達(dá)，推測(cè)PC-1可能在含牙囊腫和其他牙源性囊腫的發(fā)病和進(jìn)展中發(fā)揮作用[22]。本研究結(jié)果顯示，成釉細(xì)胞瘤中發(fā)生鱗狀化生或囊性變的腫瘤細(xì)胞PC-1與PC-2呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而牙源性角化囊腫纖維囊壁中子囊周邊的細(xì)胞兩種蛋白的表達(dá)卻為陰性。這提示PC-1與PC-2可能和成釉細(xì)胞瘤的囊性轉(zhuǎn)化有一定關(guān)聯(lián)，但是卻并未為兩種蛋白的表達(dá)與囊腫形成提供有力的證據(jù)。

目前研究發(fā)現(xiàn)，PC-1是一種機(jī)械敏感受體，具有受體功能的結(jié)構(gòu)和特征，能夠?qū)C(jī)械刺激轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)生化信號(hào)[23]；而PC-2是一種較小的跨膜蛋白，屬于鈣通道的瞬時(shí)受體電位家族，它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子，影響細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞極性等多種特征[6]。本研究結(jié)果顯示，成釉細(xì)胞瘤組PC-1與PC-2主要表達(dá)于細(xì)胞核明顯極性倒置的成釉細(xì)胞樣細(xì)胞，且PC-2的表達(dá)強(qiáng)于PC-1；而兩種蛋白在牙源性角化囊腫組上皮襯里呈極性倒置的基底細(xì)胞卻呈陰性或弱陽(yáng)性表達(dá)。推測(cè)PC-1與PC-2可能對(duì)成釉細(xì)胞瘤中腫瘤細(xì)胞的功能存在影響，尤其是可能影響腫瘤細(xì)胞的極性，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示，PC-1與PC-2在實(shí)性/多囊型和單囊型成釉細(xì)胞瘤及實(shí)性/多囊型成釉細(xì)胞瘤各病理亞型中的分布和陽(yáng)性表達(dá)率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測(cè)這可能是由于實(shí)性/多囊型和單囊型成釉細(xì)胞瘤病理變化相似，鏡下均由極性倒置的成釉細(xì)胞樣細(xì)胞和星網(wǎng)狀層樣細(xì)胞構(gòu)成所致。但也不排除此結(jié)果與成釉細(xì)胞瘤樣本尤其是單囊型成釉細(xì)胞瘤樣本較少有關(guān)，因此需要擴(kuò)大樣本來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，PC在成釉細(xì)胞瘤的表達(dá)可能與其發(fā)生發(fā)展，局部侵襲的生物學(xué)特性及成釉細(xì)胞瘤的囊性轉(zhuǎn)化有關(guān)，這為探索成釉細(xì)胞瘤新的早期診斷和治療方法提供了線索。(本文圖見封三)