碘油與葡聚糖微球栓塞兔肝VX2移植瘤療效對比

谷鐵樹，李 博，吳勇超，郝曉光，史 博，李智崗

(河北醫科大學第四醫院放射科，河北 石家莊 050011)

肝細胞癌是常見的惡性腫瘤,發病率、病死率極高，但由于其發病隱匿，多數患者明確診斷時已經是腫瘤中晚期,手術切除的機會少，術后復發常見。經肝動脈化療栓塞術(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)作為中晚期肝臟惡性腫瘤的首選治療方法[1]，已在世界范圍內獲得廣泛認可，而栓塞劑是肝癌介入療效最主要的影響因素。碘油雖然很早就在介入治療中獲得應用，但治療結果尚存爭議，有學者認為其存在容易形成側支循環、損傷正常肝質及毒性等缺陷[2]；葡聚糖微球已廣泛應用于肝臟惡性腫瘤、腎臟惡性腫瘤、腎上腺腫瘤、肺腫瘤、子宮良惡性腫瘤等實體腫瘤的介入治療中,可對末梢微動脈形成可靠栓塞，不可吸收、無毒性、抗原性，已獲得很好的療效。本研究通過對比上述2種栓塞材料栓塞兔VX2肝移植瘤前后的CT灌注參數及免疫組織化學結果，比較2種材料的治療結果。現報告如下。

1 材料與方法

1.1荷瘤兔制備 新西蘭大白兔50只(補實驗動物的實驗室和編號)，雌雄不限，于肝臟接種VX2瘤株細胞制備的濃度為1×105/mL的懸液。種植后14 d行CT灌注增強掃描確認種植成功[3]。

1.2分組 制備成功的肝腫瘤兔50只隨機分為2組，每組25只。進行肝臟腫瘤栓塞對照研究。

1.3CT灌注掃描及圖像后處理 將荷瘤兔全身麻醉后固定，經兔耳緣靜脈以團注法注入碘對比劑，對荷瘤兔肝臟行三期動態灌注掃描，應用肝腫瘤灌注模塊對數據后處理，將荷瘤兔的腹主動脈與肝臟門靜脈分別設為流入的動脈與流入的靜脈，把腫瘤明顯強化區域與其周圍肝實質設成興趣區，獲得荷瘤兔肝臟腫瘤與正常肝臟實質時間-密度曲線(time-density curve,TDC)和偽彩圖像，同時獲得腫瘤組織和周邊正常肝組織CT灌注的參數[4-6]。

1.4栓塞治療 掃描后次日，將荷瘤兔隨機分組，以1%利多卡因經耳緣靜脈全身麻醉荷瘤兔后仰臥固定于實驗臺，于兔右下肢股動脈搏動最明顯處切開皮膚肌層并分離暴露股動脈，結扎股動脈遠端，穿刺股動脈并留置穿刺針鞘管，隨后經穿刺鞘管用微導管先后行荷瘤兔腹腔動脈及肝固有動脈造影，確定腫瘤供血動脈走行、腫瘤位置及腫瘤大小，分別以碘油及葡聚糖微球對荷瘤兔肝腫瘤行超選擇行動脈栓塞。術后予荷瘤兔每日慶大霉素4萬U肌內注射，連續3 d，預防感染。

1.5栓塞治療后處理 栓塞治療后14 d對2組荷瘤兔行再次CT灌注掃描。掃描方法同1.1。掃描后處死荷瘤兔，分離完整肝臟腫瘤組織(包括腫瘤周圍的正常肝質)進行抗CD34及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor ，VEGF)免疫組織化學染色。

1.6觀察參數

1.6.1CT灌注掃描參數 組織血流量(blood flow,BF)、組織血容量(blood volume,BV)、肝動脈供血分數(hepatic arterial fraction,HAF)、肝動脈灌注量(hepatic arterial perfusion,HAP)及門靜脈灌注量(portal vein perfusion,PVP)，肝動脈灌注指數(hepatic arterial index，HPI)及門靜脈灌注指數(portal venous perfusion index,PPI)。

1.6.2免疫組織化學染色法 通過采用過氧化物酶標記的聯酶卵白素染色法獲得肝臟腫瘤切片的VEGF與CD34染色陽性的微血管密度(microvascular density，MVD)結果。

1.7統計學方法 應用SPSS 13.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1荷瘤兔的CT灌注參數結果 進行栓塞治療前2組荷瘤兔的肝臟腫瘤CT灌注參數BF、BV、HAF、HAP、PVP之間，差異無統計學意義(P>0.05);而進行栓塞治療后碘油組BF、BV、HAF、HAP均大于葡聚糖微球組，碘油組PVP小于葡聚糖微球組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 CT灌注參數對比Table 1 Comparison of CT perfusion parameters

2.2免疫組織化學結果 對2組荷瘤兔栓塞后的肝臟腫瘤組織標本進行免疫組化染色，結果顯示在荷瘤兔肝腫瘤周邊正常肝組織內未見或僅見少量VEGF和CD34染色，而荷瘤兔肝臟腫瘤組織標本活性區域內免疫組織化學染色后VEGF和CD34的表達量，葡聚糖微球組較碘油組表達少，2組間的MVD差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1～4，表2。

Figure 1 The expression of CD34 in dextran microspheres group(SP ×200)

表2 免疫組織化學CD34、VEGF的MVD 比較Table 2 MVD comparison of CD34 and VEGF by immunohistochemistry

3 討 論

目前肝癌的介入栓塞治療仍然是不能手術的中晚期肝癌首選治療方法[1]。經動脈化療栓塞治療的主要效果來自于肝動脈栓塞，碘油是目前臨床上廣泛使用的栓塞劑之一，已獲得良好的效果。近年來，各種材料的微球類栓塞劑先后面試，在臨床上廣泛應用，也取得了很好的治療效果，獲得了部分專家的認可。而微球類栓塞劑是否具有與碘油一樣或者更佳的栓塞效果，仍是專家學者討論的熱點[7]。葡聚糖是一種天然非動物來源的多糖分子，易于化學修飾，可通過化學方式制備成球狀的葡聚糖顆粒，它很難溶解于水，不溶解于酒精、乙醚等有機溶劑，能均勻地栓塞微小動脈，是一種較理想的長效末梢動脈栓塞劑，已較多應用在臨床腫瘤介入治療中。本研究試圖通過對2種栓塞材料栓塞前后兔肝移植瘤CT灌注參數的變化及免疫組織化學結果的統計學分析，對比2種栓塞材料的栓塞效果。

3.1CT灌注參數的比較 CT灌注成像(CT perfusion imaging，CTPI)可定量分析腫瘤區域血液供應情況，已經在臨床上普遍用來評價肝癌介入栓塞治療的效果。李珊玫等[8]、劉璐璐等[9]研究顯示CT灌注成像可以量化評價肝臟腫瘤的血流灌注狀態，對肝癌介入治療方案的選擇及術后栓塞效果的評價具有重要意義。本實驗統計學分析結果表明，雖然栓塞后荷瘤兔肝腫瘤內仍然存在血流灌注，但葡聚糖微球組腫瘤內的血液流量及肝動脈灌注流量均低于碘油組，而荷瘤兔肝臟門靜脈的灌注量高于碘油組。這說明應用葡聚糖微球栓塞腫瘤供血動脈比應用碘油栓塞對荷瘤兔肝臟腫瘤的血液供應效果更加確切，而對門脈灌流量影響較碘油小。有臨床研究表明，使用碘油栓塞后腫瘤供血動脈后，肝癌周圍容易有側支循環建立，分析原因可能為化療藥物與油碘混懸時碘油顆粒大小不一，直徑較大碘油液滴無法進入周圍小動脈行末梢栓塞，后期血流沖刷導致部分血管再通，同時較碘油小液滴可通過肝血竇進入門靜脈栓塞周圍正常肝組織，造成門靜脈灌注減少。葡聚糖微球表面帶有相同微電荷，球體相互排斥，不宜凝集成較大集團引起沉淀[10]，因此可于碘對比劑與鹽水以特定比例形成的混合液中懸浮，這可以使得微球在進行腫瘤供血動脈栓塞的過程中，不會因為微球間相互聚集形成沉淀，在栓塞過程中造成微導管阻塞；肝臟血竇直徑7～12 μm，毛細血管前終末微動脈內徑<50 μm，葡聚糖微球直徑50～500 μm，可以栓塞100 μm左右的微動脈，有效阻止腫瘤周圍動脈與腫瘤供血動脈建立側支循環的同時，卻無法通過終末微動脈及肝血竇進入門靜脈，栓塞周圍正常肝組織，可以更加有效地避免腫瘤患者肝臟功能的損傷以及栓塞治療術后各種介入并發癥的發生[11]。

3.22組間的免疫組織化學參數比較 臨床研究表明，腫瘤的生長、復發及轉移與腫瘤血管的生成密切相關，因此腫瘤的新生血管的情況決定了介入栓塞的效果[12-13]。林繼宗等[14]研究表明腫瘤供血動脈栓塞2 d以內，碘油在腫瘤組織內沉積覆蓋范圍最大，動脈閉塞最完全；7 d以后腫瘤組織內的VEGF表達開始出現上調，并隨著時間的延長逐漸升高，在術后21 d達到峰值；術后7～14 d腫瘤組織內微血管開始形成，術后21 d有小動脈血管出現，28 d有明顯新血管的生成。腫瘤的血管形成是一個極其復雜的過程，包括血管內皮基質降解、內皮細胞移行、內皮細胞增殖、內皮細胞管道化分支形成血管環及形成新的基底膜等步驟。在整個腫瘤血管形成期間，腫瘤細胞與血管內皮細胞之間通過分泌細胞刺激因子互相影響，參與并促進血管形成的因子種類眾多，其中VEGF是一種高度特異性的促血管內皮生長因子，在腫瘤血管形成過程中發揮最重要的作用，可促進血管通透性增加、細胞外基質變性、血管內皮細胞遷移、增殖和血管形成等，尤其是在低氧狀態下，其作用更加明顯[15]。CD34是一種重糖化I型跨膜蛋白，屬于唾液黏液蛋白家族成員，在各種血管源性腫瘤劑多種腫瘤間質中小血管的表達已經得到證實，可引起血管內皮細胞的遷移。因而，VEGF與CD34是提示新生腫瘤血管的重要指標。MVD值是一種較直觀地反映腫瘤新生血管增生情況的方法，可作為評價腫瘤血管生成程度的客觀標準，目前已獲得國內外學者公認。有研究表明，TACE術后阻斷了肝腫瘤的供血動脈，殘留腫瘤組織在低氧狀態下，可通過多種機制上調促血管生成因子的表達，促進肝腫瘤血管的形成，與周圍建立側支循環[16]。本次實驗通過測定2種栓塞劑栓塞荷瘤兔后肝臟腫瘤組織的VEGF與CD34表達的MVD值，顯示葡聚糖微球組栓塞后荷瘤兔肝臟腫瘤組織的VEGF與CD34的MVD表達平均值均比碘油組低。這說明栓塞治療后前者的肝臟腫瘤新生供血血管數量較后者的少，證明前者的栓塞效果更佳。徐強等[17]在介入治療子宮肌瘤時表明，葡聚糖微球可在生理鹽水和等量的含碘造影劑混合液中穩定懸浮，在子宮動脈栓塞的過程不易阻塞微導管，更易進入遠端的微動脈，從而更好抵御動脈血流的沖刷，在末梢的微小動脈形成穩固的栓塞，阻斷腫瘤的血液供應。葡聚糖微球的這種特性在本次對荷瘤兔肝腫瘤栓塞實驗中表現地非常明顯，栓塞后荷瘤兔肝腫瘤組織的免疫組織化學VEGF及CD34的MVD表達平均值均比碘油組低。

通過本次應用2種不同栓塞劑栓塞荷瘤兔肝臟腫瘤的實驗研究，對獲得的實驗數據進行對比分析結果顯示，應用葡聚糖微球栓塞荷瘤兔肝臟腫瘤供血動脈后，對血流的阻斷效果要優于碘油，栓塞后不易形成側支循環，同時栓塞對腫瘤周圍正常肝臟組織影響小，并且葡聚糖微球無抗原性及毒性，避免了因碘油毒性對肝功能的損害導致的碘油用量限制。由于篇幅所限，本次實驗未對2種栓塞劑對肝功能損傷情況進行研究，將在以后實驗中完善。