金剛藤對(duì)肝纖維化大鼠肝功能及肝纖維化指標(biāo)的影響▲

李 凱 秦 堅(jiān) 黃李平 呂軍影

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，南寧市 530021，電子郵箱：likaizhongxiyi@yeah.net；2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南寧市 530021)

金剛藤屬于壯藥，主產(chǎn)于廣西、湖南等地區(qū)，具有祛風(fēng)利濕、活血化瘀、解毒散結(jié)等功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金剛藤提取物具有抑制炎癥、減輕水腫、改善血液循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗衰老、抗氧化等藥理作用[1]。金剛藤作為一種民間常用藥，多用于治療婦科炎癥、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、 跌打損傷等病，其臨床效果較為肯定[2]。臨床上常將其作為活血化瘀藥和補(bǔ)虛藥，或者清熱藥、理氣藥，用于肝病的治療[3]。但金剛藤對(duì)肝纖維化的干預(yù)效果如何，鮮見(jiàn)研究報(bào)告。本研究探討金剛藤對(duì)肝纖維化大鼠肝功能及肝纖維化指標(biāo)的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只周齡6～8周的SD大鼠，雌雄各半，平均體重200 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK桂2014-002。

1.2 主要藥品及試劑 四氯化碳分析純購(gòu)自天津市化學(xué)試劑公司，將四氯化碳與花生油(魯花牌)按4 ∶6的比例調(diào)制成濃度為40% 四氯化碳花生油混合液備用。金剛藤干燥厚片購(gòu)于廣西醫(yī)藥公司(批號(hào)：14392014003)。總膽紅素、白蛋白、ALT、AST試劑盒由北京生物技術(shù)研究所提供(批號(hào)：JLC1728、JLC1586、JLC1033、JLC1905)。透明質(zhì)酸、層粘連蛋白(laminin，LN)、Ⅳ型膠原和Ⅲ型前膠原(procollagen type Ⅲ，PCⅢ)試劑盒由北京生物技術(shù)研究所提供(批號(hào)：CK-E30401R、CK-E30645R、CK-E91483R、CK-E30178R)。

1.3 分組及動(dòng)物模型的制作 將50只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按隨機(jī)數(shù)字表法將其分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、金剛藤低劑量組、中劑量組、高劑量組。除正常對(duì)照組外，其余4組大鼠參照文獻(xiàn)[4]制作動(dòng)物模型：第1周按5 mL/kg腹腔注射40% 四氯化碳混合液1次；第2周開(kāi)始按3 mL/kg腹腔注射40% 四氯化碳混合液，每周2次，共6周；第8周開(kāi)始，按3 mL/kg腹腔注射40%四氯化碳混合液，每周1次，共4周。5組大鼠均給予普通飼料喂養(yǎng)和飲用自來(lái)水。

1.4 金剛藤水煎劑的制備 金剛藤水煎劑由廣西醫(yī)科大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室制備：將200 g金剛藤浸泡20～30 min，水浸過(guò)藥面約2 cm，武火(1 800 W)煮沸后改用文火(600 W)煎30 min，冷卻30 min后濾渣取汁；藥渣按上述步驟再煎煮2次，分別取汁，將每次獲得的藥液混合，用文火煮濃縮至100 mL左右，配制成2 g/mL金剛藤水煎劑，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 給藥方法 根據(jù)成人每日金剛藤用量為20 g，按照人鼠體表面積換算法給藥，計(jì)算方法如下：(20÷60)×6.25×0.25=0.5g。將該常規(guī)藥量設(shè)為中劑量，低劑量為0.25g,高劑量為1 g，即分別為2 g/(kg·d)、1 g/(kg·d)、4 g/(kg·d)的2 g/mL金剛藤水煎液，體積分別為0.25 mL、0.1 mL、0.5 mL。建模第8周開(kāi)始，金剛藤低劑量組、中劑量組、高劑量組分別灌胃相應(yīng)劑量的金剛藤水煎液，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組給予10 mL/kg的生理鹽水灌胃，均1次/d，給藥4周。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 標(biāo)本采集：末次灌胃后，大鼠禁食，不禁水，12 h后以10%水合氯醛麻醉大鼠,心臟采血，3 500 r/min離心10 min后，取上清液,置于4個(gè)EP管中，將EP管置于-80℃冰箱保存待檢。

1.6.2 指標(biāo)檢測(cè)：采用賴氏法檢測(cè)ALT、AST、白蛋白、總膽紅素水平；采用酶聯(lián)免疫吸納法檢測(cè)透明質(zhì)酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原水平，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 5組大鼠血清ALT、AST、ALB、TBIL水平的比較 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組ALT、AST、總膽紅素水平升高，白蛋白水平下降(均P<0.05)。模型對(duì)照組、金剛藤低、中、高劑量組ALT、AST、總膽紅素水平依次降低，白蛋白水平依次升高(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 5組大鼠血清ALT、AST、ALB、TBIL水平的比較(x±s)

2.2 5組大鼠血清透明質(zhì)酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原水平的比較 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組透明質(zhì)酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原水平均升高(均P<0.05)。模型對(duì)照組、金剛藤低、中、高劑量組透明質(zhì)酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原水平依次降低(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 5組大鼠血清透明質(zhì)酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原的比較(x±s，ng/mL)

3 討 論

病毒、毒性物質(zhì)、免疫系統(tǒng)紊亂、寄生蟲(chóng)感染、過(guò)量飲酒等均可導(dǎo)致肝臟損傷，如損傷得不到及時(shí)修復(fù)則可誘發(fā)肝纖維化。肝纖維化過(guò)程是慢性肝損傷的修復(fù)反應(yīng)，表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積[5]，而肝纖維化是肝炎發(fā)展為肝硬化的中心環(huán)節(jié)。肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞的增生和激活，活化的肝星狀細(xì)胞合成大量細(xì)胞外基質(zhì)并沉積，最終導(dǎo)致肝纖維化形成。

ALT主要存在肝細(xì)胞內(nèi)，各種肝炎均可導(dǎo)致ALT水平升高；而肝臟細(xì)胞壞死時(shí)，線粒體中的AST溢出也可導(dǎo)致血清AST水平升高。因此血清ALT、AST水平可反映肝臟損傷情況。肝臟損傷發(fā)展至一定程度后，其代謝能力下降，導(dǎo)致白蛋白降低，并引起總膽紅素水平升高。本研究結(jié)果顯示，模型對(duì)照組大鼠ALT、AST、總膽紅素水平高于正常對(duì)照組，而白蛋白水平低于正常對(duì)照組(均P<0.05)，提示四氯化碳成功誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞損傷。

研究顯示，血清透明質(zhì)酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原水平可以用于評(píng)估細(xì)胞外基質(zhì)的平衡與降解的動(dòng)態(tài)過(guò)程[6]。其中，透明質(zhì)酸是肝細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)多糖，其主要由肝間質(zhì)成纖維細(xì)胞合成、分泌，而大部分由內(nèi)皮細(xì)胞攝取和分解。當(dāng)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞受損，透明質(zhì)酸出現(xiàn)分解障礙，即肝內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞增生，肝血流受阻使肝竇內(nèi)皮細(xì)胞攝取和分解透明質(zhì)酸減少；而當(dāng)發(fā)生肝纖維化時(shí)，肝星狀細(xì)胞合成大量的透明質(zhì)酸，但機(jī)體清除透明質(zhì)酸能力下降，造成血清透明質(zhì)酸升高。LN是肝細(xì)胞基底成分中的主要黏蛋白，與膠原、蛋白多糖、糖胺多糖等共同構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)。肝纖維化時(shí)肝竇中LN過(guò)度合成而降解減少，堆積增多，導(dǎo)致血清LN水平升高。高水平的LN在某種程度上能夠反映肝竇毛細(xì)血管化的程度和門脈區(qū)纖維化范圍，與肝臟病理?yè)p傷程度密切相關(guān)[7]。PCⅢ是在細(xì)胞外形成原膠原前，被氨基端肽酶切下后進(jìn)入血液循環(huán)的氨基端尾肽，與Ⅲ型膠原代謝有關(guān)。血清PCⅢ水平升高，間接提示肝臟Ⅲ型膠原合成增多。PCⅢ水平與肝纖維化程度密切相關(guān)，在肝纖維化早期其水平升高明顯，晚期合成速度減慢，是肝纖維化的活動(dòng)性指標(biāo)之一[8]。Ⅳ型膠原是構(gòu)成基底膜的主要成分，當(dāng)肝細(xì)胞持續(xù)損傷時(shí)，在肝臟修復(fù)過(guò)程中，肝儲(chǔ)脂細(xì)胞中用于合成細(xì)胞外間質(zhì)的各組分增加，Ⅳ型膠原過(guò)度合成，表現(xiàn)為血清Ⅳ型膠原水平顯著升高，從而促進(jìn)肝纖維的形成。Ⅳ型膠原水平升高可反映出肝纖維化過(guò)程，是肝纖維化早期指標(biāo)之一[9]。近年來(lái)，血清透明質(zhì)酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原水平這4項(xiàng)肝纖維化指標(biāo)，已被認(rèn)為是預(yù)測(cè)慢性肝病患者病情進(jìn)展和治療效果的指標(biāo)，是評(píng)估炎癥活動(dòng)度、纖維化程度的重要依據(jù)。

肝纖維化是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病理形態(tài)學(xué)概念，中醫(yī)古籍中無(wú)肝纖維化之詞，其分屬“黃疸”“脅痛”“積聚”“臌脹”“肝積”等病證范疇。《金匱要略·黃疸病脈證并治》曰：“黃家所得，從濕得之”。王振常等[10]認(rèn)為肝纖維化病位在肝脾腎，基本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜，基本病理因素有濕、熱、毒、虛、痰、瘀等。正氣虛弱是內(nèi)因，濕熱疫毒是外因，痰濁瘀血是病理產(chǎn)物。肝炎病毒作為肝纖維化的主要病因與中醫(yī)濕熱疫毒有相似之處，濕熱與疫毒膠著難去則導(dǎo)致疾病持續(xù)存在和慢性進(jìn)展。肝藏血，主疏泄，體陰而用陽(yáng)，濕熱疫毒纏綿難去則可損傷肝臟，導(dǎo)致肝臟氣血失調(diào)，瘀阻脈絡(luò)，因此血瘀是貫穿始終的病機(jī)關(guān)鍵，肝纖維化的各個(gè)證型都是在此基礎(chǔ)上演變過(guò)來(lái)的[11]。肝纖維化基本證型為氣陰虛損、瘀血阻絡(luò)，根據(jù)其臨床表現(xiàn)可分為肝膽濕熱型、肝郁脾虛型、肝腎陰虛型，治療原則為清熱利濕、疏肝健脾、益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、滋養(yǎng)肝腎[12]。周語(yǔ)平等[13]研究發(fā)現(xiàn)，治療肝纖維化的中藥以補(bǔ)虛藥、活血化瘀藥、清熱利濕藥居多，且療效較好。而目前對(duì)單味藥抗肝纖維化的研究也有一定的進(jìn)展，主要有丹參、三七、銀杏、黃芪、苦參、半枝蓮等，其抗肝纖維化有效成分多為皂苷類、黃酮類、生物堿類、氨基酸類等[14-15]。金剛藤主要化學(xué)成分有黃酮、皂苷、生物堿、氨基酸、有機(jī)酸、多糖等，研究表明金剛藤具有清熱利濕、活血化瘀、解毒散結(jié)等功效[16]。而根據(jù)肝纖維化病因病機(jī)、疾病演變過(guò)程的特點(diǎn)，以及肝病治療原則主要為扶正固本、疏肝解郁、活血化瘀、清熱利濕，我們認(rèn)為金剛藤有望用于肝病治療。

本研究結(jié)果顯示，模型對(duì)照組、金剛藤低、中、高劑量組ALT、AST、總膽紅素水平依次降低，白蛋白水平依次升高(均P<0.05)。提示金剛藤水煎液可減輕肝臟炎癥反應(yīng)，促進(jìn)白蛋白合成和提高肝臟對(duì)膽紅素代謝能力，且這種作用可能呈劑量依賴性。透明質(zhì)酸、Ⅳ型膠原是肝纖維化的早期診斷指標(biāo),具有比較高的敏感度,而LN是中、晚期肝纖維化的診斷指標(biāo),具有比較高的特異性,聯(lián)合檢測(cè)這4項(xiàng)指標(biāo)能夠比較全面反映肝纖維化程度[7]。本研究結(jié)果顯示，模型對(duì)照組、金剛藤低、中、高劑量組大鼠透明質(zhì)酸、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原水平依次降低(均P<0.05)，提示金剛藤水煎液可改善大鼠肝纖維化程度，且呈劑量依賴性。

綜上所述，金剛藤水煎液可以改善四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的肝功能及纖維化程度，可能與其減輕肝臟炎癥反應(yīng)，促進(jìn)膠原纖維降解，減少細(xì)胞外基質(zhì)在肝臟中沉積有關(guān)。