淺談刺五加提取物對HepG2細胞氧化損傷的保護作用

摘要：刺五加含有多種活性物質(zhì)，具有良好的藥用價值。本研究采用水浸泡法獲得刺五加提取物。體外抗氧化實驗證明，該提取物具有良好的清除自由基能力、還原金屬銅離子能力和抑制脂質(zhì)過氧化能力。在HepG2細胞氧化損傷模型中，刺五加提取物有效保護了H2O2誘導的細胞氧化損傷。

關(guān)鍵詞：刺五加；抗氧化活性；HepG2細胞；氧化損傷

1. 引言

刺五加是一種主要產(chǎn)于我國東北地區(qū)和河北、山西部分地區(qū)的五加科五加屬灌木植物，其干燥的根、莖可入藥，其味辛、微苦、性溫，歸脾、腎、心經(jīng)，具有益氣健脾、補腎安神的功效。刺五加中含有的活性成分較多，主要有酚苷類化合物、黃酮類化合物、刺五加多糖以及多種微量元素和氨基酸等。有研究表明，刺五加具有多種藥理活性，具有抗炎、抗病毒、及抗腫瘤功效，能有效保護心血管系統(tǒng)，此外還能有效增強人體抵抗力等。亦有研究表明，刺五加提取物具有良好的抗氧化活性。陳人豪等人采用醇提法，從刺五加根莖中提取活性物質(zhì)，利用大鼠腦缺血再灌注動物模型研究了刺五加提取物對大鼠缺血腦組織的保護作用。結(jié)果顯示，刺五加提取物能有效減少腦組織缺血再灌注引起的損傷和凋亡，該保護作用可能與刺五加的抗氧化活性相關(guān)。田松陽等人采用水提法獲得刺五加水提物，在體外該水提物表現(xiàn)出良好的清除DPPH自由基能力，表明該水提物具有一定的抗氧化能力。在小鼠酒精性肝損傷模型中，刺五加皂苷改善了酒精引起的肝損傷程度，通過抗氧化作用并降低多種炎性因子，進而發(fā)揮肝保護作用。多項研究表明，刺五加提取物具有一定的抗氧化能力。本文采用水提取法獲得刺五加水提物，采用過氧化氫誘導的人肝癌細胞HepG2氧化損傷模型，探究刺五加水提物的抗氧化損傷能力。

2. 材料與方法

2.1 實驗細胞

人肝癌細胞系HepG2

2.2 實驗試劑

刺五加，DPPH，乙醇，過氧化氫，MTT，新亞銅，β-胡蘿卜素，亞油酸。

2.3 實驗方法

2.3.1 刺五加水提物制備

參考田松陽等人刺五加水提物制備方法并優(yōu)化。簡述如下：取10g刺五加并搗碎，加入蒸餾水800ml，浸泡過夜。離心除去固體物質(zhì)，將上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮，最后取濃縮液凍干。臨用前稱取凍干物制配置成10mg/ml水溶液。

2.3.2 刺五加水提物體外抗氧化檢測

采用DPPH自由基清除法、銅離子還原能力測定法（CUPRAC法）以及抑制脂質(zhì)氧化法分別測定刺五加水提物的體外抗氧化能力。

無水乙醇配制濃度為40mg/L的DPPH溶液，避光保存。刺五加水提物配置成濃度為1mg/ml水溶液。取兩支試管，0號試管作為對照分別加入DPPH溶液2ml，無水乙醇溶液1ml；1號試管作為實驗組，分別加入DPPH溶液2ml，無水乙醇950μL和刺五加提取物水溶液50μL。混勻后室溫靜置30min，測定各管溶液在517nm處的吸光度，用無水乙醇調(diào)零。計算刺五加水提物對DPPH自由基的清除率。

取兩只試管。0號試管作為調(diào)零對照組分別加入100μL的無水乙醇溶液、5mM CuSO4溶液1mL、3.75mM 新亞銅試劑1mL、乙酸銨溶液1mL和純水1mL。1號試管分別加入刺五加水提物溶液100μL、5mM CuSO4溶液1mL、3.75mM的新亞銅試劑1mL、乙酸銨溶液1mL和純水1mL。將試管混勻后室溫靜置30min充分反應，測定各管在450nm處的吸光度。

按照文獻分別制備亞油酸溶液和反應介質(zhì)溶液。取6只試管分兩組，每組3只編號為0、1、2號試管。0號試管加4ml亞油酸溶液作為調(diào)零組，1號試管加4ml反應介質(zhì)溶液和100μL無水乙醇作為對照，2號試管加4ml反應介質(zhì)溶液和100μL1mg/ml刺五加水提物溶液為實驗組。配置完畢后混勻，馬上測定第一組對照和實驗組試管在470nm處的吸光度值。第二組試管在50℃水浴孵育150min后測定對照和實驗組試管吸光度值。根據(jù)下列公式計算刺五加水提物的脂質(zhì)氧化抑制率。

2.3.3 刺五加水提物保護HepG2細胞氧化損傷

采用過氧化氫制備HepG2細胞氧化損傷模型。將生長旺盛的HepG2細胞消化并計數(shù)，以5000個細胞/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜。用培養(yǎng)液配制濃度分別為0，25，50，100，200μM的H2O2溶液，并替換原培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔換無血清培養(yǎng)液100μL，加入MTT溶液10μL，37℃孵育3h。孵育結(jié)束后吸棄孔中培養(yǎng)液，每孔加150μL DMSO充分溶解藍紫色沉淀，測定各孔490nm處的吸光度值。檢測刺五加水提物對HepG2細胞氧化損傷時，按上述方法接種96孔板，用含1mg/ml刺五加水提物的培養(yǎng)液預處理細胞3h后，替換為含0，25，50，100，200μM H2O2的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后進行MTT檢測，方法如上。

3 實驗結(jié)果

3.1 刺五加水提物體外抗氧化能力測定

DPPH自由基清除實驗表明刺五加水提物具有良好的自由基清除能力。對照組試管在517nm處的吸光度值為0.675，實驗組試管在517nm處的吸光度值為0.275，根據(jù)公式計算得出，刺五加水提物1mg/ml溶液自由基清除率可達59.3%。CUPRAC法結(jié)果顯示刺五加水提物具有良好的還原金屬銅離子能力，其實驗組吸光度值達0.683。抑制脂質(zhì)過氧化實驗結(jié)果顯示，在t=0時，對照組和實驗組的吸光度值分別為0.075和0.077；在t=150min時，對照組和實驗組的吸光度值分別為0.067和0.078，根據(jù)公式計算其脂質(zhì)過氧化抑制率為81.8%。另外，我們還發(fā)現(xiàn)，提取過程中的溫度及溶液pH值能顯著影響刺五加水提物的抗氧化活性。隨著溫度升高，刺五加水提物的抗氧化能力逐漸下降，當溫度高于50℃時，其抗氧化活性有顯著的下降；當溶液pH在5-6之間時，刺五加水提物抗氧化能力最強。

3.2 刺五加水提物保護HepG2細胞氧化損傷

MTT結(jié)果顯示，與對照相比H2O2顯著抑制了HepG2細胞活力，呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。最高濃度H2O2作用24h后，細胞活力僅為對照組的34%。而刺五加水提物預處理后有效提高了HepG2細胞活力。在無H2O2作用下，刺五加水提物略提高細胞活力，但不明顯。在25、50和100μMH2O2作用下，刺五加水提物預處理組與對照相比細胞活力顯著增加，表明刺五加水提物能有效保護HepG2細胞受到H2O2引起的氧化損傷，結(jié)果見圖1。但高濃度H2O2處理組中，刺五加水提物保護效果不明顯。

4. 結(jié)論

我們的研究結(jié)果顯示，刺五加水提物在體外有良好的抗氧化能力。能有效清除DPPH自由基、還原金屬銅離子以及抑制脂質(zhì)過氧化。在HepG2氧化損傷模型中，刺五加水提物預處理能有效保護細胞減輕H2O2引起的氧化損傷。

作者簡介：

張仁文（1986- ），男，山西朔州人，主要從事細胞和分子生物學相關(guān)研究。