環氧合酶2抑制劑對非酒精性脂肪性肝病大鼠模型回腸Acsl基因家族表達的影響

郭 珊，易世杰，陽學風，曹 婷，傅 念，周克兵，龍建武

南華大學附屬南華醫院 消化內科，湖南 衡陽 421002

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精以及其他明確損肝病因引起的肝細胞內脂質過多的沉積為主要表現的世界最常見的肝疾病[1]。環氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)是一種誘導型酶，曹名波等[2]研究表明，COX-2能夠誘導脂質過氧化反應，進而引起NAFLD，同時能夠加重肝細胞的凋亡；應用COX-2抑制劑，使COX-2表達下調，進而抑制脂質過氧化反應，減輕脂肪肝的肝組織損傷。因此，COX-2對NAFLD有調控作用。有研究[3-8]表明，長鏈脂酰輔酶A合成酶(long-chain acyl-CoA synthetases，Acsl)是酰基激活酶家族成員之一，其催化合成脂酰CoA，為哺乳動物利用脂肪酸合成各類脂質。在胚胎發育時期，腸道和肝組織是內在相互聯系的。研究[9]表明，腸道和肝之間存在多層次的相互依賴關系，腸-肝軸紊亂與一系列肥胖相關疾病密切相關，NAFLD 患者腸道通透性較正常人明顯增高。脂肪的吸收主要在小腸，小腸豐富表達Acsl基因。因此本實驗旨在探討COX-2抑制劑對NAFLD大鼠回腸Acsl基因家族表達的影響，進而明確COX-2是否能夠通過調節回腸Acsl的表達從而影響NAFLD的發展，為NAFLD的發病機制和治療新靶點的選擇提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 45只雄性SD大鼠，體質量(20±2)g，購自于上海西普爾-必凱實驗動物機構有限公司[實驗動物生產許可證號：SCXK(滬)2013-0016;實驗動物使用許可證編號：SYXK(湘)2020-0002]。高脂飼料：80.5%基礎飼料，10%蛋黃粉，7%豬油，2%膽固醇，0.5%膽鹽(南通特洛菲飼料科技有限公司)。高脂飼料購于杭州赫貝公司。伊紅、蘇木精、油紅O染液購自美國SIGMA公司，高純總RNA快速提取試劑盒購自中國上海Generay公司，逆轉錄試劑盒購自加拿大Fermentas公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物飼養、分組及給藥 45只SD雄性大鼠均在南華大學實驗動物研究中心飼養，所有SD大鼠的飼料量全部以1015 g·100 g-1·d-1的標準進行喂養。適應性喂養1周后，將所有SD大鼠根據完全隨機法分為3組，分別為：正常對照組(n=15只,普通飼料)；NAFLD模型組(n=15,高脂飼料)；尼美舒利組(n=15,高脂喂養8周后，予以尼美舒利6 mg·kg-1·d-1灌胃，連續4周)。SD大鼠全部按照之前的標準飼養，飼養到第12周處死。

1.2.2 實驗觀察和大鼠管理 飼養大鼠過程中觀察各組大鼠的毛發、精神、營養狀態、行為和食欲，嚴格按照相關規定處理及飼養所有大鼠。實驗期間所用的籠具必須定期消毒、清洗，同時需要及時整理衛生、更換墊料、消毒喂養室，飼料必須經高壓消毒后放到清潔準備間儲存，儲存時間不得超過15 d，保持飼養環境能夠長期達標。

1.2.3 各組靜脈血清學數據的測定 大鼠深度麻醉后，采取各組大鼠下腔靜脈血，以3000 r/min，離心10 min，分離血清后迅速送到南華大學附屬南華醫院檢驗科，全自動生化分析儀檢測各組大鼠靜脈血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)的數值。

1.2.4 肝組織病理學檢查 4%多聚甲醛浸泡固定肝組織后，進行石蠟包埋切片，行HE染色。用4%多聚甲醛固定肝組織2～4 h后，包埋在OCT冰凍切片中，行肝臟油紅O染色。該步驟在南華大學病理學教研室完成，需在普通光鏡下觀察切片情況并顯微照相記錄。

1.2.5 引物設計 Acsl1上游引物為5′-TGTGGTTCCGAGACTGCTA-3′，下游引物為5′-AGGCTGTTGTTTCTGACGAT-3′，片段長度為141 bp；Acsl3上游引物為5′-GGCTGAGTGGATGATTGCTG-3′，下游引物為5′-GGCTGAGTGGATGATTGCTG-3′，片段長度為128 bp；Acsl4上游引物為5′-TGGCTACTTACCTTTGGCTCAT-3′，下游引物為5′- TCACCCTTGCTTCCCTTCT-3′，片段長度為138 bp；Acsl5上游引物為5′-AACCAGTCTGTAGGGATTGAGG-3′，下游引物為5′- GGCGTCTGAGAAGTAATAAAGGAT-3′，片段長度為87 bp；Acsl6上游引物為5′-CAGTTGCTTACCCACTACTATGACG-3′，下游引物為5′-CCACCTCTTGATAGGACAGCC-3′，片段長度為87 bp；COX-2上游引物為5′-TCAGCCATGCAGCAAATCCTT-3′，下游引物為5′ -CCGTAGAATCCAGTCCGGGT-3′，片段長度為112 bp。

1.2.6 qPCR 檢測回腸Acsl的表達 Trizol-離心柱法提取總RNA，測定 RNA純度和RNA定量，取總RNA 2 μg在逆轉錄作用下反轉錄為cDNA，以此為模板，按以下程序進行PCR反應擴增:50 ℃ 3 min，95 ℃ 15 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，35循環。qPCR結束后，制作溶解曲線，反應條件為72 °C 20 s，從70 ℃開始到95 °C，每增加0.5 ℃，保持5 s，讀取吸光值。取5 μl擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，實驗結果由熒光定量PCR分析軟件BIO-RAD CFX Manager自動統計和計算，最后依照實驗數據進行統計，并根據2-ΔΔCt值繪制各樣品目的基因的相對定量直方圖。

1.3 倫理學審查 本研究方案經由南華大學附屬南華醫院實驗動物倫理委員會審批(批號：20201938)，符合實驗室動物管理與使用準則。

2 結果

2.1 一般情況 飼養大鼠過程中，觀察到對照組大鼠毛發光澤，營養狀態良好，反應迅速，食欲佳，無攻擊性。而NAFLD模型組的大鼠毛發逐漸失去光澤，營養狀態欠佳，反應遲鈍，食欲欠佳，個別有攻擊性。與NAFLD模型組大鼠比較，尼美舒利組的大鼠的毛發色澤、營養狀態、反應以及食欲均有明顯改善。正常對照組、NAFLD模型組、尼美舒利組適應性喂養1周后，按照各組喂養方式至12周。喂養0、4、8、12 周時正常對照組小鼠體質量分別為：(20.81±1.95)g、(24.65±3.86)g、(26.52±2.89)g、(28.47±3.18)g；NAFLD模型組小鼠的體質量分別為：(21.18±2.38)g、(26.21±3.45)g、(30.86±3.62)g、(32.78±3.77)g；尼美舒利組小鼠的體質量分別為：(21.96±3.06)g、(25.39±2.42)g、(30.53±2.88)g、(24.78±3.66)g。

2.2 各組大鼠TG、TC的比較 與對照組大鼠相比，NAFLD模型組大鼠血清TG、TC值均增加，且差異有統計學意義(P值均<0.05)。而與NAFLD模型組相比，尼美舒利組大鼠血清TG、TC值均下降，且差異有統計學意義(P值均<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠血清TG、TC結果(mmol/L)

2.3 肝臟HE染色分析及鏡下診斷 正常對照組：肝細胞排列規則，肝細胞核大小形態正常。肝組織、肝小葉結構完整無破損，未見炎癥細胞浸潤、肝脂肪變性、纖維間隔形成(圖1)。NAFLD模型組：肝細胞排列不規則，中央靜脈缺如，可見各細胞變大變圓，細胞氣球樣改變，大量不同大小的脂肪滴。肝組織結構破壞明顯，可見纖維間隔、假小葉、大量壞死及炎癥細胞浸潤、明顯肝脂肪變性(圖2)。尼美舒利組：肝細胞排列尚規則，細胞輕度腫脹，可見數個直徑較小的脂滴，肝小葉結構基本正常，未見假小葉和纖維間隔(圖3)。

2.4 肝臟油紅O染色分析及鏡下診斷 正常對照組：細胞邊界清晰，細胞質豐富不顯色，細胞核膜完整無破壞，細胞核為深藍色，無紅色脂滴(圖4a)。NAFLD模型組：細胞邊界模糊，整個視野可見脂肪顆粒，表現為大小不等的紅色斑點，期間可見散在深藍色的細胞核(圖4b)。尼美舒利組：細胞邊界尚完整，整個視野可見少量紅色脂肪顆粒，紅色顆粒與NAFLD模型組比較明顯減少，可見少許散在深藍細胞核(圖4c)。

2.5 qPCR法檢測回腸COX-2及Acsl家族基因的基因表達情況 與正常對照組大鼠相比，NAFLD模型組大鼠回腸COX-2的表達明顯升高(P<0.05)；與NAFLD模型組大鼠相比，尼美舒利組回腸COX-2的表達明顯降低(P<0.05)。與正常對照組相比，NAFLD模型組回腸Acsl3、Acsl5基因的表達明顯增加(P值均<0.05)；與NAFLD模型組相比，尼美舒利組Acsl3、Acsl5基因的表達明顯降低(P值均<0.05)(表2)。

3 討論

NAFLD主要由肥胖、胰島素抵抗、遺傳易感性和線粒體、內質網的氧化應激導致[10]。早期NAFLD患者無明顯臨床癥狀[11]。在NAFLD 病情發展中，脂肪堆積過多，肝細胞發生變性、壞死，最終可形成肝纖維化，導致肝硬化[12-13]。NAFLD也是西方國家最常見的慢性肝病病因，預計到2030年NAFLD將成為肝移植最常見的適應證[14]。NAFLD 主要發生于肥胖人群，與代謝綜合征及糖尿病的發生發展密切相關。隨著生活質量的不斷提高，發病率逐年上升，嚴重危害人類健康，治療和預防越來越引起人們的重視。NAFLD 發病機制十分復雜，尚未完全明確，近年來對發病機制的認識由“二次打擊學說”逐漸向“多重打擊模型”轉變[15]。目前，許多研究多集中在闡明NAFLD發生發展的相關因素，這些相關因素被稱為“多重平行打擊”，它們能夠促使肝脂肪變向更復雜更嚴重的NAFLD病程進展[16]。這些相關因素包括：腸道菌群失調[17]、飲食結構改變[18]、腸道通透性變化[19]、相關基因改變[20]、內質網應激反應[21]以及相關信號通路活化等[22]。

表2 各組回腸中COX-2、Acsl1、Acsl3、Acsl4、Acsl5、Acsl6基因的表達水平

COX-2是一種誘導型酶，正常情況下，大部分組織不表達COX-2，只有在各種炎癥因子及癌基因等刺激下才會表達。脂質在回腸消化吸收過多引起脂肪代謝紊亂，誘導毒性脂代謝產物沉積與活性氧化物質生成過多，引起炎癥反應，從而使COX-2表達增加。同時，COX-2能夠加重脂質過氧化反應，誘導肝細胞的凋亡從而引起NAFLD。應用COX-2抑制劑，可以抑制脂質過氧化反應，進而緩解脂肪肝的脂肪變性和肝細胞損傷[23]。有研究[24]表明，小腸黏膜受損狀況下，COX-2的表達增加，且與炎癥程度呈正相關。同時有實驗[25]發現，炎癥小腸上皮COX-2水平較正常小腸上皮明顯增加，而經槲皮素處理后小腸黏膜損傷情況好轉，其COX-2表達明顯降低。本研究結果表明：與正常對照組比較，NAFLD模型組回腸COX-2表達明顯升高，與NAFLD模型組比較，尼美舒利組大鼠回腸上COX-2表達明顯降低。NAFLD的回腸COX-2呈高表達，說明COX-2參與回腸脂質反應，應用COX-2抑制劑尼美舒利后，可以改善肝組織損傷、減輕肝脂肪變性。

Acsl家族基因有5個亞型，分別為Acsl1、Acsl3、Acsl4、Acsl5、Acsl6，這5種基因在組織特異性以及底物特異性上都存在一定區別，但都具有相同的催化作用：催化游離脂肪酸合成脂酰CoA[26]，參與TG的合成。Acsl3作為長鏈脂酰CoA合成酶家族中的一員，主要生理功能是調節細胞內脂質代謝，催化長鏈脂肪酸激活的第一步，參與脂質合成和蛋白質修飾。有研究[27]發現，Acsl3在高脂飼養大鼠模型肝組織中呈高表達，且血中TG、游離脂肪酸明顯升高；抑制Acsl3表達后，脂酰CoA合成酶活性降低，最終使肝臟脂質沉積減少，說明下調Acsl3的表達可以改善肝纖維化。Bauer等[28]研究證實，通過下調小腸上依賴Acsl3誘導的脂質合成，加氏乳桿菌能夠減少腸道脂質代謝，改變腸道內環境，說明抑制小腸Acsl3可以減少脂質合成。Acsl5作為長鏈脂酰CoA合成酶家族中的一員，豐富表達于小腸，參與脂質合成和分解代謝。Reinartz等[29]研究證實，脂肪肝的大鼠可上調Acsl5的表達，脂肪酸的攝取增多，TG合成增加，抑制肝細胞增殖，促進肝細胞凋亡。有研究[29]表明，棕櫚酸或油酸能夠使肝星狀細胞中Acsl1、Acsl5、Acsl6的表達上調，而應用COX-2后能拮抗棕櫚酸或油酸誘導的Acsl5、Acsl6表達上調，從而抑制肝星狀細胞脂化，促進其活化而引起肝纖維化。

小腸是脂質吸收的重要場所，本研究發現，COX-2在NAFLD大鼠回腸末端高表達，其可能通過促進回腸過多的脂質消化吸收引起脂肪代謝紊亂。COX-2有調控Acsl家族某些基因的作用。本課題組前期實驗[8]已證明，COX-2能通過調節肝星狀細胞上Acsl1、Acsl4、Acsl6的表達，從而改變肝星狀細胞的活性，參與NAFLD的發生發展。同時有研究[30]表明，尼美舒利對COX-2的抑制作用抑制了肝臟炎癥和纖維化發生，并降低了NAFLD的胰島素抵抗。本實驗通過qPCR法檢測回腸Acsl3及Acsl5的表達情況，結果表明，NAFLD模型組與正常對照組相比，回腸Acsl3、Acsl5的表達顯著增加，而與NAFLD模型組相比，尼美舒利組回腸Acsl3、Acsl5的表達顯著下降。因此推斷：Acsl3、Acsl5參與回腸脂質代謝，COX-2在回腸末端可能通過啟動Acsl3及Acsl5參與脂質合成的作用，從而參與NAFLD的發生發展，COX-2抑制劑尼美舒利可能通過下調回腸Acsl3、Acsl5的表達，改善脂肪肝大鼠的肝臟脂肪變和纖維化，但其中具體機制還需組進一步研究。

本實驗結果同時顯示，NAFLD模型組與正常對照組相比，Acsl1、Acsl4、Acsl6表達均無明顯變化，尼美舒利組與NAFLD模型組相比，Acsl1、Acsl4、Acsl 6的表達均無明顯變化，因此可知，Acsl1、Acsl4、Acsl6在脂肪肝小鼠和正常小鼠的回腸上表達無明顯變化，回腸上Acsl1、Acsl4、Acsl6可能不參與NAFLD的過程，Acsl1、Acsl4、Acsl6可能通過其他途徑參與NAFLD的進展。

本實驗表明，尼美舒利可以下調脂肪肝大鼠回腸Acsl3、Acsl5的表達，其具體作用機制尚待進一步研究證實。更深入地研究COX-2抑制劑與回腸Acsl3、Acsl5的功能及其調控關系，可對探索NAFLD治療靶點提供新的途徑。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：郭珊、易世杰、曹婷、陽學風負責課題設計，資料分析，撰寫論文；郭珊、傅念、周克兵、龍建武參與收集數據，修改論文；陽學風負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。