蝦青素對腦出血大鼠的神經(jīng)保護作用及機制

周子薇，鄭曉梅，先耀，涂婷，左清嬌

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000

腦出血是指非外傷性腦實質(zhì)內(nèi)出血，具有較高的致殘率和病死率。現(xiàn)治療腦出血的有效藥物較少，減輕腦出血繼發(fā)性的腦損傷是當(dāng)前研究的熱點和難點。腦出血后血腫壓迫、腦組織水腫被認為是影響患者恢復(fù)的重要原因，而血腦屏障被破壞是導(dǎo)致腦水腫的重要原因[1]。蝦青素是海洋生物體內(nèi)主要的類胡蘿卜素，易通過血腦屏障，具有強抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性[2]。因其具備多種生物學(xué)活性，又可以通過血腦屏障，因此對帕金森病、阿爾茲海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有治療作用。研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素能明顯改善腦創(chuàng)傷、腦梗死、脊髓損傷、帕金森病等疾病的神經(jīng)功能，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[3]。目前,關(guān)于蝦青素對腦出血神經(jīng)保護作用的報道較少。2018年12月～2019年12月，我們通過構(gòu)建腦出血大鼠模型，觀察蝦青素對腦出血大鼠的神經(jīng)保護作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級健康雄性SD大鼠168只，8周齡，體質(zhì)量180～220 g，購于成都達碩實驗動物有限公司。大鼠分籠飼養(yǎng)，自由進食及飲水。飼養(yǎng)室保持清潔通風(fēng)，相對濕度、溫度恒定，全天12 h時間光照。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實驗。

1.1.2 主要試劑與儀器 蝦青素購于Macklin公司，分別取4、8 mg蝦青素加入2 mL金龍魚花生油，配置成2、4 mg/mL的混懸液。伊文思藍(EB)染料購自上?？道噬锟萍加邢薰荆逖装Y因子TNF-α、IL-1β ELISA檢測試劑盒購于ELK Biotechnology公司；人Rho關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋蛋白激酶2(ROCK2)兔抗大鼠抗體購于CST公司，緊密連接蛋白5(Claudin5)兔抗大鼠抗體購于Bioss公司。普通光學(xué)顯微鏡為日本OLYMPUS產(chǎn)品。

1.2 動物分組與造模 將168只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為模型對照組、低劑量蝦青素組、高劑量蝦青素組各42只。術(shù)前禁食8 h，6%水合氯醛腹腔麻醉，固定于腦立體定位儀上。暴露顱骨前囟及冠狀縫，定位右側(cè)尾狀核(以前囟為中心，向后0.2 mm，右側(cè)旁開3 mm，深6 mm)，鉆孔。模型組從鼠尾靜脈取血50 μL，采用“改良二次注血法”注血；假手術(shù)組注射等量生理鹽水。注射完成后，緩慢拔針并縫合切口[4]。造模2 h后對模型組進行Longa評分[5]，1～3分為造模成功。

1.3 干預(yù)方法 低劑量蝦青素組、高劑量蝦青素組分別給予蝦青素20、40 mg/(kg·d)灌胃[6]，假手術(shù)組、模型對照組分別給予等體積花生油灌胃，連續(xù)7 d。

1.4 神經(jīng)功能評價 分別于藥物干預(yù)1、3、7 d，采用Garcia法進行神經(jīng)功能評分，最高分18分，評分越低表示神經(jīng)功能障礙越嚴重[5]。

1.5 血清TNF-α、IL-1β水平檢測 于藥物干預(yù)1、3、7 d，每組分別隨機取6只大鼠，采集尾靜脈血1 mL，離心取上清液，采用ELISA法測定血清TNF-α、IL-1β水平，按照試劑盒說明書步驟操作。

1.6 腦組織含水量測定 于藥物干預(yù)1、3、7 d，每組分別隨機取4只大鼠，常規(guī)稱重、麻醉，斷頭取腦組織，稱取濕重;100 ℃烘烤箱內(nèi)烘烤24 h，稱取干重。腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.7 血腦屏障通透性觀察 采用EB染色。于藥物干預(yù)1、3、7 d，每組分別隨機取4只大鼠，經(jīng)尾靜脈注射2% EB，3 h后常規(guī)稱重、麻醉。暴露心臟，固定灌注針，右心耳處剪小口形成灌注液排出通道，生理鹽水灌注至清亮液體流出。取腦組織，稱取濕重。制備腦組織勻漿，加3 mL甲酰胺溶液，60 ℃恒溫箱孵育48 h，1 600 r/min離心25 min，取上清液，分光光度計于波長632 nm處測定吸光度值。繪制標準曲線計算EB濃度，根據(jù)公式計算EB含量，以此表示血腦屏障通透性。EB含量(μg/g腦濕重)=EB濃度(μg/mL)×甲酰胺容積(mL)/濕重(g)。

1.8 腦組織ROCK2、Claudin5蛋白表達檢測 采用免疫組化SP法。將上述取尾靜脈血后的大鼠常規(guī)稱重、麻醉，暴露心臟，固定灌注針，按1.6方法灌注生理鹽水。待清亮液體流出后，換成4%多聚甲醛灌注，直至大鼠上半身僵硬。迅速斷頭取腦組織，常規(guī)甲醛固定，石蠟包埋，切片、脫水、PBS反復(fù)漂洗；EDTA微波修復(fù)、PBS漂洗、避光孵育、漂洗；加封閉液、去除封閉液加一抗ROCK2、Claudin5，4 ℃過夜，PBS漂洗后加二抗孵育50 min，PBS漂洗；加DAB溶液在顯微鏡控制顯色，沖洗；蘇木素復(fù)染，氨水返藍，沖洗，梯度乙醇脫水、透明、封固，普通光學(xué)顯微鏡(400×)下觀察腦組織染色情況。應(yīng)用Image-Pro Plus6.0軟件選取相同的棕黃色作為陽性標準，分析每張照片陽性的累積光密度值(IOD)。

2 結(jié)果

2.1 四組干預(yù)不同時間神經(jīng)功能評分比較 見表1。

表1 四組干預(yù)不同時間神經(jīng)功能評分比較(分，

2.2 四組干預(yù)不同時間血清TNF-α、IL-1β水平比較 見表2。

表2 四組干預(yù)不同時間血清TNF-α、IL-1β水平比較

2.3 四組干預(yù)不同時間腦組織含水量及血腦屏障通透性比較 見表3。

表3 四組干預(yù)不同時間腦組織含水量及EB含量比較

2.4 四組干預(yù)不同時間腦組織ROCK2、Claudin5蛋白表達比較 見表4。

表4 四組干預(yù)不同時間腦組織ROCK-2、Claudin5蛋白表達比較

3 討論

蝦青素屬于萜烯類不飽和化合物，分子式為C40H52O4，具有很長的共軛烯烴雙鍵，其兩個終端均含酮基和羥基，極性端可猝滅單線態(tài)氧，非極性中間段又能清除氧自由基，故其具備超強的抗氧化能力[6，7]。此外，蝦青素還能夠抑制ROS，調(diào)控Nrf2通路[8]；參與線粒體調(diào)控的凋亡通路，抑制caspase3表達；調(diào)控炎癥反應(yīng)等[3，9]。研究顯示，蝦青素可以通過超強的抗氧化能力改善蛛網(wǎng)膜下腔出血小鼠的血腦屏障通透性，保護血腦屏障[10]。腦出血后，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及基質(zhì)金屬蛋白酶等因素都會使血腦屏障破壞，滲透性改變，造成腦組織內(nèi)環(huán)境紊亂，加劇腦出血后繼發(fā)性腦損傷。本研究結(jié)果顯示，大鼠腦出血后1、3、7 d神經(jīng)功能均有不同程度的受損，其中3 d時的神經(jīng)缺損癥狀最嚴重；經(jīng)蝦青素治療后，神經(jīng)功能得到明顯改善，以高劑量組效應(yīng)更明顯。同時大鼠腦出血后各時間點的腦組織含水量、EB含量明顯升高，而蝦青素治療組的腦組織含水量及EB含量均低于模型對照組，并能明顯改善3 d腦水腫高峰期的腦水腫程度，降低腦疝形成風(fēng)險，從而改善大鼠的神經(jīng)缺損癥狀，具有一定的神經(jīng)保護作用。

血腦屏障是由小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、緊密連接等構(gòu)成的一道血液與腦組織、腦脊液之間的屏障，具有選擇性轉(zhuǎn)運、維持腦組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要作用，也對腦水腫的形成和發(fā)生起著關(guān)鍵作用[11]。ROCK2和Claudin5蛋白是調(diào)節(jié)血腦屏障通透性的重要因子。ROCK2即Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶2，主要在大腦、脊髓表達，其底物有肌球蛋白輕鏈磷酸酶、肌球蛋白等，具有調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞收縮、黏附、遷移、凋亡等作用[12]。同時被認為是調(diào)節(jié)血腦屏障通透性的有效靶點，其與LPS誘導(dǎo)的緊密連接蛋白水平降低有關(guān)[13]。腦出血后血腫所釋放的凝血酶、血紅蛋白及分解代謝產(chǎn)物可能會激活ROCK2蛋白，使其表達水平增加，活化后的ROCK2可增加基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達，降解細胞外基質(zhì)的層粘連蛋白及內(nèi)皮細胞間的緊密連接，造成血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能破壞，加重腦水腫[14]。緊密連接是血腦屏障的重要組成部分，包括跨膜蛋白(Claudins、occludin、連接黏附分子)、胞質(zhì)附著蛋白、細胞骨架蛋白等[15]，具有主動調(diào)節(jié)功能，緊密連接的改變可造成血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能異常。Ohtsuki等[16]發(fā)現(xiàn)，外源性表達的Claudin5可誘導(dǎo)血腦屏障生成，Claudins還可參與氧化應(yīng)激、胞內(nèi)鈣離子吸收等病理生理過程，在缺血性腦損傷時，Claudin5被MMP降解，血腦屏障滲透性升高，同時它也是重要的滲透性調(diào)節(jié)因子，其下降程度可反映血腦屏障通透性的破壞情況[17]。

本研究結(jié)果顯示，腦出血大鼠成模1 d時模型對照組、蝦青素治療組腦組織中ROCK2蛋白表達水平開始升高，Claudin5蛋白表達減少，3 d時效應(yīng)最明顯。這與血腦屏障通透性增加、腦組織含水量升高結(jié)果一致，說明腦出血后ROCK2蛋白激活導(dǎo)致Claudin5蛋白被分解，破壞了血腦屏障緊密連接，加劇腦組織水腫；而與模型對照組相比，蝦青素治療組各時間點腦組織中ROCK2蛋白表達減少，Claudin5表達升高，腦水腫程度減輕，血腦屏障通透性得到改善。這提示蝦青素可能通過抑制ROCK2過度表達起到保護腦組織的作用，且高劑量組優(yōu)于低劑量組。另一方面，腦出血后大鼠血清炎癥因子IL-1β、TNF-α水平升高，這可能與活化的ROCK2促進NF-κB向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，加劇炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)有關(guān);蝦青素治療組不同時間點IL-1β、TNF-α水平較模型對照組均下降，提示蝦青素可抑制腦出血后的炎癥反應(yīng)，從而減輕細胞毒性腦損害，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

綜上所述，蝦青素能夠抑制腦出血后的炎癥反應(yīng)，減輕細胞毒性腦損害；同時改善血腦屏障通透性和減輕腦水腫，改善腦出血大鼠早期腦損傷的神經(jīng)功能；其機制可能是通過抑制ROCK2蛋白表達、保護Claudin5蛋白來發(fā)揮作用。