滄州地區豬源肺炎克雷伯菌分離菌株、耐藥性及耐藥基因檢測

董 瑞，孫 曉

(滄州職業技術學院，河北 滄州 061000)

肺炎克雷伯菌是肺炎克雷伯菌屬主要成員菌之一，該菌可以分為肺炎克雷伯肺炎亞種、臭鼻亞種和鼻硬結亞種3個亞種，3個亞種中肺炎克雷伯肺炎亞種分布最為廣泛，是引發多種動物發病的主要病原菌之一[1-2]。肺炎克雷伯菌可以引起豬、牛、羊、狐貍、水貂、雞等多種動物及人發病，臨床上主要表現為敗血癥、腦膜炎、肺炎、支氣管炎、泌尿系統及創傷感染等[3-4]。當豬感染肺炎克雷伯菌后，可以引起嚴重的呼吸道感染、敗血癥等，發病率和死亡率均較高，嚴重者可以造成急性死亡[5]。臨床中抗菌藥物是防治該病的主要手法，臨床中隨著抗菌藥物的不合理使用，肺炎克雷伯菌對抗菌藥物出現廣泛的耐藥性，對該病防治帶來了很大的困難[6-7]。

本試驗從滄州地區不同養殖場中采集患呼吸道疾病豬肺臟、肝臟、鼻拭子等病料組織123份,分離得到了67株肺炎克雷伯菌。通過人工感染試驗結果表明，45株均為致病性肺炎克雷伯菌。因此，對45株致病性肺炎克雷伯菌耐藥性和耐藥基因進行檢測，為該地區肺炎克雷伯菌的防治提供參考依據。

1 材料

1.1 病料來源 滄州地區不同養殖場中采集患呼吸道疾病豬肺臟、肝臟、鼻拭子等病料組織123份，進行病原菌分離鑒定。

1.2 主要試劑與儀器 普通營養培養基、麥康凱肌醇阿東醇羧芐青霉素瓊脂培養基(MIAC)、營養肉湯，均購自廣東環凱微生物科技有限公司；陰性菌鑒定試紙條、常用抗菌藥物藥敏紙片，均購自上海宸功生物技術開發公司；細菌基因組DNA試劑盒、2×TaqMaster Mix，均購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA D2 000 Marker，購自北京中科瑞泰生物科技有限公司；VITEK2型全自動細菌鑒定系統由法國生物梅里埃公司生產；多功能梯度 PCR儀由美國 ABI 公司生產；常規試劑和儀器均由本實驗室提供。

1.3 實驗動物 昆明系小鼠340只，體重(22±2) g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

2 方法

2.1 細菌分離培養 采集患呼吸道疾病豬肺臟、肝臟、鼻拭子等病料組織123份，經過處理后，劃線接種于普通瓊脂培養基，37 ℃恒溫培養12～18 h，挑取優勢單個菌落，接種于MIAC培養基上進行鑒別培養，37 ℃恒溫培養12～18 h。挑取單個菌落在營養肉湯中純化培養后進行染色鏡檢和生化鑒定。

2.2 細菌生化特性鑒定 按照說明書將純化培養的分離菌株菌液調整成0.5麥氏濁度，加入陰性菌鑒定試條中，在37 ℃培養12～24 h，用VITEK2型全自動生化鑒定系統儀對分離菌株進行生化特性鑒定。

2.3 分離菌株的16S rRNA PCR鑒定 按照說明書，用細菌基因組DNA試劑盒提取分離菌株的基因組DNA，用細菌的16S rRNA基因序列通用引物5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′/5′-GTGGCGGACG-GGTGAGTAA-3′對分離菌株進行PCR檢測，用1%瓊脂糖檢測其目的條帶后，將分離菌株的目的基因PCR產物進行測序，測序結果與GenBank中登錄的肺炎克雷伯菌參考株的基因序列進行同源性比較與分析。

2.4 分離菌株致病性試驗檢測 參考文獻[2]，對分離菌株人工感染小鼠進行致病試驗。采用平板計數法將菌液濃度調整為(108CFU/mL)，每株分離菌腹腔注射5只小鼠，劑量為0.3 mL(108CFU/mL)，對照組腹腔注射等量的營養肉湯。在攻毒12 h后，觀察每組小鼠的發病及死亡情況，對于死亡的小鼠進行細菌分離與鑒定。

2.5 分離菌株的藥敏試驗與耐藥性分析 按照美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)(2017年)推薦的標準K-B紙片法對分離的致病性病原菌進行藥敏試驗，參照CLSI的標準判斷耐藥(R)、敏感(S)或中介(I)進行結果判斷，分析其耐藥性。

2.6 分離菌株的耐藥基因PCR檢測 參考文獻[8-9]，設計12對耐藥基因的引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。PCR體系為25 μL:2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA 2 μL，ddH2O 9.5 μL。用梯度PCR進行耐藥基因檢測，PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果與GenBank中登錄的肺炎克雷伯菌參考株的基因序列進行同源性比較與分析。

表1 耐藥基因的引物序列

3 結果

3.1 細菌分離與培養 疑似肺炎克雷伯菌分離菌株在普通營養瓊脂上長出圓形的、扁平的、灰白色的半透明菌落；在鑒別MIAC培養基上為大小一致的、圓形的、桃紅色的菌落；革蘭染色鏡檢為兩端鈍圓粗短桿菌狀的陰性菌。

3.2 細菌生化特性鑒定 分離菌株不發酵D-麥芽糖、D-葡萄糖、D-纖維二糖、D-海藻糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、D-山梨醇、L-鼠李糖；甲基紅試驗、V-P試驗均呈陽性；L-阿拉伯醇、精氨酸雙水解酶、鳥氨酸脫羧酶、接觸酶、尿素酶為陰性；不產生H2S；67株分離菌株用全自動化微生物生化均鑒定為肺炎克雷伯菌，評定結果合格率為98.9%～99.9%。

3.3 分離菌株的16S rRNA PCR鑒定 分離的67株分離菌株均擴增出大約為1 500 bp左右的目的基因條帶，與預期的一致(圖1)，67株分離菌株的測序結果與GenBank中登錄的肺炎克雷伯菌參考株的基因序列同源性在97.9%～100.0%。證實了67株分離菌株分離菌為肺炎克雷伯菌。

圖1 部分分離菌株16S rRNA PCR檢測結果M:D2 000 DNA Maker;1～10:分離菌株

3.4 分離菌株的致病性試驗檢測 攻毒組的小鼠在攻毒后的2～3 d，出現不同程度的發病與死亡，直到試驗結束。從死亡小鼠體內分離到了肺炎克雷伯菌，對照組小鼠無明顯的癥狀及死亡。致病性試驗結果表明，45株肺炎克雷伯菌分離株對小鼠具有致病性，為致病性肺炎克雷伯菌。

3.5 細菌耐藥性分析 結果由表2可知，45株致病性肺炎克雷伯菌分離菌株對阿莫西林、氨芐西林、氟苯尼考、環丙沙星、慶大霉素、阿米卡星、多西環素、磺胺間甲氧嘧啶、多黏菌素9種藥物耐藥性較高，耐藥率在55.6%～100%；對頭孢噻呋、頭孢曲松、恩諾沙星、大觀霉素、林可霉素5種藥物耐藥率在13.3%～22.2%。

表2 分離菌株藥敏試驗結果

由表3可知，45株致病性肺炎克雷伯菌分離菌株呈現多種耐藥性，耐14種藥物的有1株，耐13種藥物的有4株,耐11種藥物的有11株,耐10種藥物的有13株,耐9種藥物的有6株，耐8種藥物的有5株，耐7種藥物的有3株，其中耐11、10種藥物分離菌株最多，分別占分離菌株的24.4%、28.9%。

表3 分離菌株多重耐藥性結果

3.6 分離菌株的耐藥基因PCR檢測 結果由表4可知，45株致病性肺炎克雷伯菌分離菌株中攜帶8種不同的種耐藥基因，總檢出率為66.7%(9/12)，其中blaTEM、ant(3″)-Ⅰa、aph(3′)-Ⅱa、sul2、sul3 五種耐藥基因檢出率較高，檢出率在80.0%～100%；blaSHV、floR、qnrA三種耐藥基因檢出率相對較低，檢出率在37.8%～46.7%；blaCTX-M、mcr-1、qnrS、rmtB四種耐藥基因未檢出。45株致病性肺炎克雷伯菌分離菌株耐藥基因PCR產物測序結果與GenBank中登錄的肺炎克雷伯菌參考株的基因序列同源性在97.6%～99.9%。

表4 分離菌株耐藥基因檢測結果

4 討論

肺炎克雷伯菌是廣泛分布于自然界中的一種人獸共患的條件性致病菌，該菌主要存在多種動物及人的呼吸道、消化道等，可以引起多種家畜、家禽及人發病，當外界環境改變時，該菌可以導致動物體內的菌群失調，引起動物感染發病，嚴重者可以造成死亡[10]。本試驗從滄州地區不同養殖場中采集患呼吸道疾病豬肺臟、肝臟、鼻拭子等病料組織123份，分離得到了67株肺炎克雷伯菌。說明了該地區豬肺炎克雷伯菌感染嚴重，在該地區廣泛流行。通過人工感染試驗結果表明，45株為致病性肺炎克雷伯菌。因此，對該地區分離的45株為致病性肺炎克雷伯菌進行耐藥性和耐藥基因檢測。

相關研究表明了臨床中分離的肺炎克雷伯菌耐藥性比較嚴重，對常用藥物產生廣泛的耐藥性，多重耐藥菌株出現的越來越多，同時降低了治療效果[11]。本試驗結果表明，45株致病性肺炎克雷伯菌分離菌株對阿莫西林、氨芐西林、氟苯尼考等9種藥物耐藥性較高，耐藥率在55.6%以上；對其他藥物耐藥率在13.3%～22.2%；分離菌株呈現多重耐藥現象，耐11、10種藥物分離菌株最多，分別占分離菌株的24.4%、28.9%。從而證實了該地區分離的45株致病性肺炎克雷伯菌對常用的藥物產生很強的耐藥性，呈現多重耐藥性。因此，在養豬過程中應該引起重視。劉海林[12]報道豬源的肺炎克雷伯菌對一代頭孢類、磺胺類藥物和四環素耐藥性較強。王羽等[2]研究表明，從吉林省不同地區豬場分離的致病性肺炎克雷伯菌對強力霉素、大觀霉素及阿米卡星的耐藥性較強。董萌萌等[13]研究表明，從河南地區分離的肺炎克雷伯菌對氨芐西林、先鋒霉素IV、先鋒霉素V等多種藥物耐藥。與本試驗結果存在一定的差異性，可能與用藥頻率和地區有關。本試驗結果表明，blaTEM、ant(3″)-Ⅰa、aph(3′)-Ⅱa、sul2、sul3五種耐藥基因檢出率較高，檢出率在80.0%以上；blaSHV、floR、qnrA三種耐藥基因檢出率在37.8%～46.7%；blaCTX-M、mcr-1、qnrS、rmtB四種耐藥基因未檢出，說明該地區分離的45株致病性肺炎克雷伯菌攜帶耐藥基因復雜。與蒙正群等[1]報道存在一定差異性，可能與該菌感染的宿主有關。分離的45株為致病性肺炎克雷伯菌對常用的抗生素產生的耐藥性是否與攜帶耐藥基因有關，有待進一步研究。本試驗為該地區肺炎克雷伯菌的防治提供參考依據。