固相萃取-高效液相色譜法測定紡織品中的有害抗菌劑

徐韻揚，秦 鑫，顧 虎，胡 喆，王敏超，吳 怡

(杭州市質量技術監督檢測院，浙江 杭州 310019)

紡織品所用抗菌劑主要分為有機抗菌劑、無機抗菌劑和天然抗菌劑3大類。有機抗菌劑應用時間最久，是目前織物用抗菌劑的主要產品[1]，具有見效快、殺菌能力強的優點，但存在毒性大，耐熱性差，易遷移且會產生微生物耐藥性等缺點[2-3]。部分有機抗菌劑已被證實具有危害性，其中2—(4—噻唑)—苯并咪唑、α—溴肉桂醛[4]、三氯卡班、4—氯—3—甲基苯酚這4種有機抗菌劑不僅會破壞人體皮膚黏膜的微生態平衡，還具有致畸性，甚至誘發癌變等危害[5]。建立紡織品中有毒有害抗菌劑的有效檢測方法可以加強抗菌紡織品風險預警。

目前，抗菌劑檢測研究的對象主要為醫藥[6-7]、化妝品[8-9]、食品及食品包裝材料和環境樣品[10]等。以紡織品為研究對象的研究較少，且已有文獻主要是討論紡織品中的三氯生的檢測[11]。本文以α—溴肉桂醛、三氯卡班、2—(4—噻唑)—苯并咪唑、4—氯—3—甲基苯酚這4種有機抗菌劑為目標物，研究了固相萃取前處理凈化技術，優化高效液相色譜分離條件，建立了紡織品中4種有毒有害抗菌劑快速檢測方法，實現準確定性和定量分析紡織品中有毒有害抗菌劑。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

1260型高效液相色譜儀，配二極管陣列DAD檢測器(安捷倫科技有限公司)；KQ-250TDE型高頻數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水儀(美國密理博有限公司)。

試劑：抗菌劑，三氯卡班、α—溴肉桂醛、2—(4—噻唑)—苯并咪唑、4—氯—3—甲基苯酚；甲醇、乙腈(色譜純，美國天地有限公司)；超純水(18.2 mΩ·cm)。

測試樣品：綠色純棉抗菌防臭襪、白色純棉抗菌襪、灰色純棉抗菌T恤、白色純棉抗菌針織棉布、印花絲綢圍巾，均為市售樣品。

1.2 配制標準溶液

分別稱取2—(4—噻唑)—苯并咪唑(a)、4—氯—3—甲基苯酚(b)、α—溴肉桂醛(c)、三氯卡班(d) 4種抗菌劑標準品 25 mg，以乙腈為溶劑，定容至25 mL，配制成質量濃度為1 000 mg/L的單標儲備液，置于4 ℃保存。混合標準工作液的配置方法：移取一定體積的單標儲備液，用乙腈稀釋成0.1、0.5、2.0、10.0、50.0 mg/L。

1.3 試驗陽性樣品的制備

按照抗菌劑100 mg/kg，軋余率100%左右，30 ℃堆置24 h的后整理工藝對市售普通棉織物用混合標準溶液浸泡，然后在室溫條件下自然風干，后整理加工成試驗用陽性樣品，供試驗條件優化使用。

1.4 樣品前處理

取1.1中市售樣品和1.3所制備的樣品(下文簡稱試樣)，將其剪碎至5 mm×5 mm，混勻。稱取1.0 g(精確至0.001 g)試樣于50 mL玻璃具塞反應瓶中，準確加入25 mL體積比為甲醇/四氫呋喃75/25的萃取液，超聲提取30 min。將提取液抽濾，取1.0 mL濾液加至固相萃取小柱，用10 mL甲醇淋洗，棄去流出液，再用5 mL體積比為乙酸乙酯/乙腈4/1溶液洗脫，接收全部洗脫液。洗脫液氮吹至干，用甲醇定容至1.0 mL，過0.45 μm聚四氟乙烯PTFE濾膜，待高效液相色譜法HPLC分析。

1.5 色譜條件

反相色譜柱：安捷倫Eclipse XDB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5μm)；流動相：乙腈與水體積比為30∶70；等梯度分析12 min，流速為1.0 mL/L；柱溫為30 ℃；檢測波長為230、265、300 nm；進樣量為10 μL。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的確定

通過高效液相色譜(HPLC)對4種有毒有害抗菌劑單標儲備液的分析，獲得各目標物在吸收波長200～400 nm范圍內的液相光譜圖(見圖1)。為實現目標物的定性和定量分析，確定檢測波長為230、265、300 nm。

圖1 4種有毒有害抗菌劑的液相光譜圖

2.2 色譜分離條件的優化

本文所研究的4種抗菌劑既不屬于離子化合物，也無異構體及強親水或強疏水基團，因此優先選用適用性及分離效果均較好的反相色譜(RPC)作為分離模式研究。試驗對比了2根不同的Eclipse XDB-C18反相色譜柱，柱1：SB-Phenyl苯基液相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；柱2：Eclipse XDB-C18液相色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)。不同色譜柱對4種有毒有害抗菌劑的分離色譜圖的比較見圖2。在以10 mmol/L乙酸銨-乙腈為流動相時，柱1存在較嚴重的拖尾現象，柱2能較好地實現目標物的分離，且分離度及選擇性佳，故試驗選用色譜柱2進行試驗。

圖2 不同色譜柱對4種有毒有害抗菌劑的分離色譜圖的比較

乙腈-水流動相可用于低波長(185～210 nm)紫外線檢測，具有黏度低、塔板數高、柱壓低等優點。因此試驗在Eclipse XDB-C18液相色譜柱(150 mm×4.6 mm，5μm)基礎上，流動相優先選用乙腈-水作進一步研究。反相色譜(RPC)中用來改變樣品選擇性的參數主要有流動相組成、柱類型和柱溫，其中流動相組成的改變是最為有效且方便的[12]。試驗通過改變乙腈體積比例來比較不同溶劑強度對目標物選擇性的影響。結果顯示，當乙腈體積分數為70%時，4種目標物可在10 min內得到最佳的分離度及保留值，4種有毒有害抗菌劑混合標準溶液的液相色譜圖見圖3。

圖3 4種有毒有害抗菌劑混合標準溶液的液相色譜圖

2.3 前處理條件的優化

紡織品抗菌劑一般在后整理階段添加到產品中，為實現紡織品中抗菌劑的檢測，首先需要把抗菌劑從紡織品中提取出來。本文研究采用超聲萃取法來提取樣品中的抗菌劑，優化萃取劑種類、萃取溫度、萃取時間3個條件是提高超聲萃取效率的關鍵。首先考察甲醇/四氫呋喃8/2、甲醇/四氫呋喃5/5、甲醇/四氫呋喃3/7作為萃取劑對目標物的萃取效率。稱取1.0 g(精確至0.001 g)自制的陽性樣品，分別加入上述4種萃取劑，超聲萃取30 min，觀察4種待測抗菌劑的萃取效率。不同萃取劑對4種抗菌劑的萃取率見圖4。可以看出，甲醇-四氫呋喃二元體系萃取效率優于單一的甲醇萃取劑；二元萃取劑體系中四氫呋喃比例的提升，萃取效率逐漸增大，故試驗選擇甲醇/四氫呋喃體積比3/7作為萃取劑。

圖4 不同萃取劑對4種有毒有害抗菌劑的萃取效率

為取得超聲萃取的最大萃取效率，試驗還分別對比了萃取10、20、30、40、60 min以及不同萃取溫度的萃取效率。結果顯示，隨著萃取時間的提高，萃取效率不斷提升，當萃取時間超過30 min，萃取效率趨向平穩；而萃取溫度的變化對目標物萃取效率幾乎沒有影響。綜合考慮試驗室溫度條件的影響，選擇萃取時間30 min，萃取溫度30 ℃作為下一步研究的條件。

在進行樣品分析時，發現樣品顏色對目標物的檢測有較大干擾，主要是由于顏色多樣的樣品通常加入不同成分的染料以及各種助劑，這些染料和助劑會和目標物一同被萃取下來，造成分析干擾。為準確高效地分析目標物，試驗采用固相萃取法對萃取樣液進行凈化處理。固相萃取法可以將目標物萃取得更徹底，降低雜質對目標物的干擾。試驗對150 mg/mL的混合型弱陰離子Oasis WAX、500 mg/mL的強陽離子(SCX)和200 mg/(6 mL)的Select HLB 3種固相萃取柱進行了萃取效果比較，3根固相萃取柱的上樣量均為1.0 mL，分段收集檢測流出液。結果顯示，Oasis WAX固相柱在上樣液中未檢出目標物，在隨后的5 mL甲醇洗脫液中檢出4種目標物，且萃取液的凈化效果不顯著；HLB固相萃取柱，在上樣液流出液中就能檢出目標物，且雜質峰干擾嚴重；SCX固相萃取柱，在上樣液流出液和5 mL甲醇洗脫液中未檢出4種目標物，在后續的5 mL體積比為乙酸乙酯/乙腈4/1的洗脫液種檢測到目標物，回收率在80%～100%，且萃取液凈化除色效果明顯，可明顯消除雜質對目標物的干擾。因此選擇SCX固相萃取柱進行萃取液的凈化。

2.4 線性關系、檢出限和定量限

按優化后的儀器條件，測試質量濃度為0.5、5.0、20.0、50.0、100.0 mg/L系列的混合標準溶液，以目標物的色譜峰面積為縱坐標y，相應質量濃度為橫坐標x繪制標準曲線，所得各待測物擬合曲線相關系數R2均大于0.999，以3倍信噪比確定儀器檢出限為0.1～0.3 mg/L，結合樣品稱樣量和稀釋倍數，以10倍信噪比確定方法定量限為2.2～3.6 mg/kg，4種有毒有害抗菌劑的分析見表1。

表1 4種有毒有害抗菌劑的分析

2.5 回收率與精密度試驗

采用1.3工藝制備的陽性樣品，按照本文固相萃取-高效液相色譜法的試驗方法進行處理，按每個試驗添加質量濃度平行試驗6次計算回收率，測得平均回收率為86.5%～100.3%，相對標準偏差小于5%，4種有毒有害抗菌劑加標回收率和相對標準偏差見表2。

2.6 實際樣品測定

采用本文方法對1.1中5個市售測試樣品中的抗菌劑進行檢測，結果僅在印花絲綢圍巾中檢出4—氯—3—甲基苯酚，含量為28.6 mg/kg，其余樣品未檢出抗菌劑。5個市售樣品中抗菌劑檢測結果見表3。根據測試結果可知，目前市售抗菌紡織產品中存在使用有毒有害抗菌劑情況，但是大部分抗菌產品具有相對安全性。

3 結束語

本文通過固相萃取-高效液相色譜法對紡織品中三氯卡班、α—溴肉桂醛、2—(4—噻唑)—苯并咪唑、4—氯—3—甲基苯酚4種有毒有害抗菌劑進行研究，從不同種類的萃取溶劑、萃取時間和萃取體積比例3個方面，對固相萃取前處理條件進行優化；從流動相組成和液相色譜柱種類，對液相色譜條件進行選擇，實現了紡織品中三氯卡班、α—溴肉桂醛、2—(4—噻唑)—苯并咪唑、4—氯—3—甲基苯酚4種有毒有害抗菌劑的固相萃取-高效液相色譜法的定性和定量分析。固相萃取-高效液相色譜法為有效控制紡織產品中有毒有害抗菌劑提供技術支撐，為深入研究有毒有害抗菌劑的環境行為和生態效應奠定技術基礎。