青海西寧地區豬肉食品中致病性沙門菌耐藥性分析

趙維章，張正英

(青海省動物疫病預防控制中心，青海 西寧 810000)

據世界衛生組織(World Health Organization,WHO)統計，食源性病原菌中的大腸桿菌和沙門菌成為畜產品污染中常見的食源性致病菌，以沙門菌對人的危害較大[1]。沙門菌呈世界性流行，被沙門菌污染的肉、蛋、奶等動物源性食品成為感染人類的主要途徑，主要引起人們腹瀉、嘔吐等癥狀，嚴重者還會引起敗血癥，甚至導致死亡，嚴重危害公共衛生安全[2]。沙門菌在自然界中具有廣泛的宿主，各種食物包括零售動物肉類食品、雞蛋、水果及蔬菜，尤其是禽、豬肉產品，被認為是沙門菌傳播和暴發的載體[3]。相關研究表明，豬是沙門菌的主要宿主，養豬場、屠宰場和市場是豬源沙門菌發生污染和傳播的主要場所，人們食用被污染的豬肉或豬肉制品后引發沙門菌病[4]。因此，加強豬肉生產、零售鏈中沙門菌的監測和防控具有重要的意義。

本試驗從青海西寧地區屠宰場、零售店、超市等采集豬肉食品樣品246份進行沙門菌分離鑒定，采用人工感染小鼠試驗、Kauffmann-White法、K-B藥敏紙片法分別檢測沙門菌的致病性、血清型及耐藥性，分析該地區豬肉食品中沙門菌污染情況與耐藥情況，為進一步防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2019年6-12月，從青海西寧地區屠宰場、零售店、超市等采集豬肉食品樣品246份進行沙門菌分離鑒定。

1.2 主要試劑 緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)、木糖賴氨酸(XLT-4)瓊脂，均購自廣東環凱微生物科技有限公司；木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂、沙門菌顯色培養基，均購自青島海博生物技術有限公司；2×TaqMaster Mix、DL-2 000 DNA Marker，均購自北京康為世紀生物科技有限公司；ID32E腸道菌生化鑒定試紙條、藥敏紙片，均購自北京天壇藥物生物技術開發公司；沙門菌屬診斷血清，購自寧波天潤生物藥業有限公司；細菌生化鑒定系統由法國生物梅里埃公司生產；PCR儀由德國Eppendorf公司生產。

1.3 實驗動物 25 g左右健康昆明系小鼠236只，購自西寧市實驗動物有限公司。

1.4 方法

1.4.1 細菌分離與培養 將采集的樣品分裝BPW，220 r/min 37 ℃培養8 h后，取100 μL 接種于TTB中，220 r/min 37 ℃培養8 h，劃線接種于XLT-4 平板，經 37 ℃培養12 h，挑取疑似沙門菌的黑色單菌落于沙門菌顯色培養基，37 ℃培養12 h，挑取沙門菌顯色培養基的紫色單菌落接種于普通營養肉湯中進行純化培養，取純化培養的細菌進行革蘭染色，顯微鏡觀察。

1.4.2 細菌生化鑒定 按說明書對純化培養的分離菌株調整為0.5個麥氏濁度，接種到ID32E腸道菌生化鑒定試紙條中培養12～24 h，用細菌生化鑒定系統進行生化特性鑒定。

1.4.3 細菌PCR鑒定 按參考文獻[5]設計沙門菌的特異性鑒定引物invA，上游為：5′-GAAATTATCGCCACGTTCGGGCA-3′，下游為：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGA-3′。引物片段大小為249 bp，由北京擎科生物科技有限公司合成。采用水煮法制備分離菌株的DNA模板，對分離菌株進行PCR鑒定，將PCR產物送北京擎科生物科技有限公司合成進行測序，測序結果與GenBank中登錄的參考株進行同源性比對。

1.4.4 細菌致病性試驗檢測 分離菌株用菌落計數法進行計數，調整濃度為1×108CFU/mL。每1株分離菌株用灌胃方式攻毒2只小鼠，劑量為0.25 mL(1×108CFU/mL)，對照組接種等量無菌的營養肉湯，攻毒的12 h后，觀察7 d，記錄小鼠的發病及死亡情況，進行細菌學鑒定。

1.4.5 細菌血清型分型檢測 按參考文獻[6]采用Kauffmann-White法對分離的沙門菌進行血清鑒定。

1.4.6 藥敏試驗 按照美國臨床檢驗標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推薦的標準K-B紙片法進行試驗操作、藥物試驗和結果判斷。

2 結果

2.1 細菌分離與培養 疑似沙門菌分離菌株在XLT-4 平板上長出圓形、大小一致、濕潤的、黑色的單菌落；在沙門菌顯色培養基上長出單個、大小一致、邊緣整齊的紫色菌落。革蘭染色鏡檢可見單個或成對存在、無芽孢、無莢膜、兩端鈍圓的陰性短桿菌。經統計246份樣品中分離到了117株疑似沙門菌的菌株。

2.2 細菌生化試驗 分離菌株用ID32E腸道菌生化鑒定試紙條和細菌生化鑒定系統進行鑒定，117株被鑒定為沙門菌，評定結果合格率為99.7%～99.9%。其生化鑒定結果與報道的沙門菌的生化特性一致。

2.3 細菌PCR鑒定 用設計的沙門菌invA基因引物，對疑似菌株進行 PCR 鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，117株疑似菌株均擴增出大約為249 bp目的條帶，與預期的相符(見圖1)，分離菌株的測序結果與GenBank中登錄的13株沙門菌參考株的同源性在98.9%～99.9%。說明分離的117株菌株為沙門菌。

圖1 分離菌株的PCR鑒定結果Fig.1 Results of isolated strains PCR identificationM:DL-2 000分子量標準；1:空白對照；2～12:分離菌株M:DL-2 000 Marker;1:Blank control;2～12:Isolated strains

2.4 動物致病性試驗 攻毒組小鼠在攻毒后2～6 d 出現不同程度的死亡，主要呈現精神沉郁、采食量減少、腹瀉，個別未見臨床癥狀出現死亡，直到試驗結束，從死亡的小鼠體內分離到沙門菌，對照組的小鼠健康存活。據統計56株沙門菌能引起小鼠的死亡，為致病性沙門菌。

2.5 血清型檢測 對分離的56株致病性沙門菌進行血清型鑒定。由表1可知，56株致病性沙門菌分別屬于10種不同的血清型，其中以豬霍亂沙門菌、鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌3種血清為主要流行致病血清型，分別占致病菌株的26.8%、21.4%和19.6%。

表1 致病性沙門菌血清型檢測Table 1 Serotype test results of pathogenic Salmonella

2.6 耐藥性分析 由表2可知，56株致病性沙門菌對氨芐西林、新霉素、阿莫西林、磺胺間甲氧嘧啶、慶大霉素5種藥物耐藥比較嚴重，耐藥率在85.7%～96.4%；對環丙沙星、紅霉素、林可霉素、強力霉素4種藥物的耐藥率在50%～75.0%；對其他藥物耐藥率在12.5%～35.7%。說明分離的56株致病性沙門菌耐藥性嚴重。

表2 藥敏試驗結果Table 2 Drug sensitivity test results

3 討論

沙門菌具有廣泛的動物宿主，可以引起多種動物和人感染，是臨床中一種重要的人獸共患病致病菌，其感染人和動物的途徑廣泛，沙門菌感染人會導致急性胃腸炎、敗血癥等疾病，嚴重者可以導致死亡，沙門菌可以引起動物的敗血癥、胃腸炎及其他組織和局部炎癥，并且會導致懷孕母畜流產[7]。相關研究表明，沙門菌主要存在于肉類食品中，人們食用被沙門菌污染的食物后也可能導致急性食物中毒，甚至引起死亡，因此，沙門菌菌株的出現和傳播對醫學、獸醫學和公共衛生十分重要[8]。沙門菌污染肉類產品引起食物中毒已經成為人們關注的熱點。

沙門菌可以感染多種宿主動物，其抗原復雜且血清型眾多，沙門菌主要包括菌體 O 抗原、鞭毛H抗原和莢膜Vi抗原，目前世界發現了2 600多種沙門菌的血清型，我國發現的沙門菌血清型就有292種，其中有20種左右特定的沙門菌血清型易引起人獸患病，如雞白痢沙門菌、鼠傷寒沙門菌、傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌、腸炎沙門菌等[2-4]。研究表明，對人和動物危害較大的沙門菌的血清型為鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌以及豬霍亂沙門菌等[5]。本試驗結果表明，從青海西寧地區采集的246份豬肉食品樣品中分離到了56株致病性沙門菌，屬于10種血清型，以豬霍亂沙門菌、鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌3種血清為主要流行致病血清型，分別占致病菌株的26.8%、21.4%和19.6%。說明該省多地區豬肉食品中分離的致病性沙門菌血清型復雜。金宣晨[4]報道了豬產業鏈中分離的沙門菌以德爾卑沙門菌(35.1%)和鼠傷寒沙門菌(31.0%)為優勢血清型。李鵬[6]報道了酒泉市市售冷凍羊肉分離的沙門菌以鼠傷寒型和德比型所占比例最高。張強等[9]報道了從楊凌及周邊地區零售分割雞肉中分離的34株沙門菌中共檢出10種血清型，其中科瓦利斯沙門菌最為流行。與本試驗均有一定差異性，可能與地區及分離不同種類的動物肉類有關。

沙門菌易產生耐藥性，沙門菌耐藥性可以通過抗生素耐藥質粒、整合子和轉座子攜帶的可轉移元件作為抗生素耐藥性傳遞的供體，可以通過抗生素耐藥基因元件一起轉移，將編碼耐藥基因轉移到不同宿主上，促進具毒性和耐藥性的細菌分離株的出現，通過食物鏈在人和動物中傳播[10]。因此，沙門菌耐藥性對人和動物危害較大。本試驗結果表明，分離的56株致病性沙門菌分離株對氨芐西林、新霉素、阿莫西林等9種藥物耐藥率在50%以上，對其他藥物耐藥率在12.5%～35.7%。表明青海西寧地區豬肉食品中分離沙門菌耐藥性嚴重，可能與該地區生豬養殖過程中不合理的使用抗菌藥物有關，應該引起重視。