基質(zhì)剛性影響聲孔效應(yīng)介導(dǎo)的單細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染?

榮 寧 汪 曣 范真真

(天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院 天津 300072)

0 引言

作為一種非病毒式、非侵入性的方法，超聲和靶向微泡結(jié)合在藥物導(dǎo)入及基因治療方面展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛能[1?4]。然而體外細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境差異巨大，導(dǎo)致體外研究成果難以直接應(yīng)用到臨床治療。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的物理特性對(duì)細(xì)胞形貌以及功能具有顯著影響[5?6]。研究表明，單獨(dú)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)剛性可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞遷移、增殖甚至分化等復(fù)雜過(guò)程的調(diào)控[7?8]。研究表明，微泡對(duì)不同模式的超聲激勵(lì)產(chǎn)生了不同程度的放大聚焦作用[9?10]，在超聲激勵(lì)下微泡空化[11]會(huì)引發(fā)細(xì)胞膜周?chē)牧黧w作用[12]，進(jìn)而影響細(xì)胞膜表面有小孔打開(kāi)，使得藥物和外源基因得以進(jìn)入細(xì)胞實(shí)現(xiàn)藥物和基因的導(dǎo)入和治療。質(zhì)粒DNA 的轉(zhuǎn)染過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的生物物理過(guò)程，該過(guò)程與微泡的空化以及細(xì)胞功能等密切相關(guān)[13?14]。體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)常用的培養(yǎng)皿材質(zhì)通常為玻璃(彈性模量值為5.1～11.9 GPa[15]) 或塑料(彈性模量值為0.1 GPa[16])，而在體組織的基質(zhì)剛性范圍則在100 kPa 以?xún)?nèi)，腦組織的基質(zhì)剛性甚至在1 kPa 以下[7]。體外細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)皿基質(zhì)剛性比體內(nèi)組織的剛性高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)，這就影響了體外細(xì)胞研究成果向臨床治療的轉(zhuǎn)化。基質(zhì)剛性如何影響質(zhì)粒DNA 的轉(zhuǎn)染效果尚不清楚。本文旨在探究細(xì)胞外基質(zhì)剛性對(duì)質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染效果的影響及規(guī)律。制作不同剛性的凝膠基質(zhì)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，獲取到基質(zhì)剛性對(duì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果的影響。并對(duì)不同基質(zhì)剛性上的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)粒DNA示蹤，以期獲取質(zhì)粒在不同剛性基質(zhì)上進(jìn)入細(xì)胞方式的差異。進(jìn)一步的細(xì)胞骨架蛋白分布從實(shí)驗(yàn)角度揭示產(chǎn)生轉(zhuǎn)染效果差異的原因。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

為了制作不同硬度的凝膠基質(zhì)，采用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyltriethoxysilane,APES)、二氯二甲基硅烷(Dichlorodimethylsilane,DCDMS)、25%(體積比)戊二醛溶液、40%(質(zhì)量體積比)丙烯酰胺原液、2%(質(zhì)量體積比)雙丙烯酰胺溶液、四甲基乙二胺(Tetramethylethylenediamine,TEMED)、過(guò)硫酸銨(Ammonium persulfate,APS)以及交聯(lián)劑sulfo-SANPAH 等試劑，均購(gòu)自sigma公司。力學(xué)信號(hào)敏感的小鼠成纖維細(xì)胞NIH 3T3采用10%胎牛血清+90%高糖DMEM 以及1%雙抗培養(yǎng)。選用SIM4-5 超聲微泡，購(gòu)自Advanced Microbubbles laboratories LLC 公司。RGD 多肽用于將微泡造影劑靶向連接在細(xì)胞膜表面。超聲實(shí)驗(yàn)示意圖如圖1所示。

圖1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)示意圖Fig.1 Schematic illustration of plasmid transfection

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

凝膠基質(zhì)制作參考文獻(xiàn)[17]中的方法，通過(guò)調(diào)節(jié)丙烯酰胺單體和雙體比例實(shí)現(xiàn)對(duì)凝膠基質(zhì)剛性的調(diào)節(jié)。制作硬度不同的凝膠基質(zhì)，采用原子力顯微鏡赫茲模型對(duì)凝膠基質(zhì)的楊氏模量進(jìn)行檢測(cè)。最終用于實(shí)驗(yàn)的軟的凝膠基質(zhì)測(cè)得的楊氏模量值為(0.2±0.05) kPa，硬的凝膠基質(zhì)楊氏模量為(40±1.2) kPa。I型膠原蛋白溶液稀釋到50 μg/mL，滴加到用Sulfo-SANPAH 活化過(guò)的凝膠基質(zhì)上，室溫靜置過(guò)夜，使膠原蛋白溶液充分吸附到凝膠基質(zhì)表面。傳代前向凝膠基質(zhì)表面加入完全培養(yǎng)基室溫孵育30 min。將攜帶凝膠的玻璃底培養(yǎng)皿置于生物安全柜內(nèi)紫外滅菌0.5 h。將NIH 3T3 傳代到凝膠基質(zhì)上，細(xì)胞密度為104細(xì)胞/cm2。37?C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞融合度達(dá)到60%。

選用攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因的質(zhì)粒DNA進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。選擇單脈沖串超聲激勵(lì)，聲壓在0.45 MPa，超聲持續(xù)10 μs。質(zhì)粒DNA 濃度為10 μg/ml。超聲激勵(lì)結(jié)束后將細(xì)胞更換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)放回二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。為了研究凝膠基質(zhì)的剛性對(duì)聲致穿孔誘導(dǎo)的質(zhì)粒DNA 導(dǎo)入效果的影響，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒DNA 進(jìn)行示蹤，采用Cy3對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記。用Cy3標(biāo)記過(guò)的質(zhì)粒DNA進(jìn)行超聲實(shí)驗(yàn)。超聲激勵(lì)前，采用Hoechst 33342 對(duì)細(xì)胞核染色。超聲激勵(lì)結(jié)束后5 min，采用4%多聚甲醛室溫下對(duì)細(xì)胞固定10 min。磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer saline,PBS)沖洗2次。共聚焦顯微鏡三維層掃細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒DNA分布。層掃間距為1 μm。

采用FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞骨架蛋白進(jìn)行染色，對(duì)照組對(duì)分別培養(yǎng)在0.2 kPa 和40 kPa 硬度的凝膠基底上的細(xì)胞進(jìn)行固定染色。實(shí)驗(yàn)組選用聲壓為0.45 MPa 的單脈沖串超聲對(duì)分別培養(yǎng)在0.2 kPa和40 kPa硬度的凝膠基底上的細(xì)胞進(jìn)行超聲激勵(lì)。超聲脈沖串持續(xù)時(shí)間為10 μs。超聲激勵(lì)后40 s 吸走培養(yǎng)皿內(nèi)的PBS 緩沖液，采用4%的多聚甲醛溶液立即對(duì)超聲激勵(lì)后的細(xì)胞固定10 min。PBS 緩沖液沖洗3 次，加入FITC 標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽，終濃度為10μg/mL。室溫孵育40 min。PBS緩沖液沖洗3次。滴加10 μL Hoechst 33342溶液進(jìn)行細(xì)胞核染色10 min。共聚焦顯微鏡(Olympus FV3000，60倍油鏡)三維掃描熒光成像。

每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。采用Origin 8.5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用平均值± 均方根(x±m(xù))表示。采用單因素方差分析比較各實(shí)驗(yàn)組結(jié)果存在的差異，以p <0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)剛性對(duì)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效果的影響

將NIH 3T3 細(xì)胞分別培養(yǎng)在楊氏模量值為0.2 kPa、3 kPa、10 kPa、20 kPa、40 kPa的凝膠基質(zhì)上，如圖2所示，細(xì)胞培養(yǎng)在 10 kPa的凝膠基質(zhì)上時(shí)細(xì)胞形貌差別不大，細(xì)胞呈現(xiàn)出成纖維細(xì)胞梭形形貌。而0.2 kPa 凝膠上的細(xì)胞形貌則呈現(xiàn)出圓形，與40 kPa 凝膠上的細(xì)胞形貌差異很大。因此最終選取了0.2 kPa和40 kPa兩個(gè)參數(shù)研究基質(zhì)剛性對(duì)質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染效果的影響。這兩個(gè)彈性模量值也是參考文獻(xiàn)中研究基質(zhì)剛性對(duì)細(xì)胞功能影響實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的具有代表性的數(shù)值[7,18?19]。

如圖3(a)、圖3(b)所示，不同剛性的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞，在超聲激勵(lì)后24 h，細(xì)胞形貌仍然保持顯著性差異。軟的凝膠基質(zhì)上的細(xì)胞保持圓形，細(xì)胞面積更小，硬的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞延展性更好，細(xì)胞保持梭形狀態(tài)，細(xì)胞表面積更大。由綠色熒光蛋白的表達(dá)情況來(lái)看，質(zhì)粒DNA 均可以成功導(dǎo)入進(jìn)細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)表達(dá)。

圖2 不同剛性凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞形貌Fig.2 Cell morphology cultured on hydrogel with different rigidities

質(zhì)粒DNA 綠色熒光蛋白的表達(dá)效率e采用熒光顯微成像的方法收集數(shù)據(jù)，超聲實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)超聲作用區(qū)域用馬克筆進(jìn)行標(biāo)記。超聲激勵(lì)前后靶向微泡的響應(yīng)采用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行記錄。統(tǒng)計(jì)該視野下微泡發(fā)生響應(yīng)的細(xì)胞比例α。超聲激勵(lì)后24 h，對(duì)超聲激勵(lì)區(qū)域用倒置熒光顯微鏡拍攝綠色熒光，計(jì)數(shù)超聲激勵(lì)區(qū)域表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量β，以及同一視野下的細(xì)胞總數(shù)N。

如圖3(c)所示，在相同的超聲條件激勵(lì)下(0.45 MPa,10 μs)，硬的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，綠色熒光蛋白的表達(dá)效率顯著高于軟的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞。

圖3 綠色熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Fig.3 GFP expression in NIH 3T3 cells

圖4 質(zhì)粒DNA 在細(xì)胞內(nèi)的分布Fig.4 Plasmid DNA intracellular distribution

2.2 基質(zhì)剛性對(duì)質(zhì)粒DNA導(dǎo)入方式的影響

為了進(jìn)一步研究造成不同剛性基質(zhì)上質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率差異的原因，對(duì)質(zhì)粒DNA 進(jìn)行熒光標(biāo)記示蹤。由圖4熒光圖像可知，兩種不同硬度的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞，在靶向微泡位點(diǎn)附近均有質(zhì)粒DNA嵌入到細(xì)胞膜，表明對(duì)于兩種不同硬度凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞，質(zhì)粒DNA 均可以通過(guò)聲致穿孔產(chǎn)生的細(xì)胞膜小孔被導(dǎo)入進(jìn)細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞被培養(yǎng)在軟的凝膠基質(zhì)(0.2 kPa)上，細(xì)胞內(nèi)在遠(yuǎn)離微泡位點(diǎn)的空間內(nèi)觀察到更多尺度在微米級(jí)的質(zhì)粒DNA團(tuán)簇，表明質(zhì)粒DNA同時(shí)可以通過(guò)其他方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。對(duì)質(zhì)粒DNA 在細(xì)胞內(nèi)的空間分布進(jìn)行量化分析可知，軟的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞可以攝取更多的質(zhì)粒DNA，如圖5(a)所示。但硬的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞，與靶向微泡位點(diǎn)吻合的質(zhì)粒DNA 比例更高，推測(cè)當(dāng)細(xì)胞被培養(yǎng)在硬的凝膠基質(zhì)上時(shí)聲致穿孔引發(fā)的細(xì)胞膜小孔是質(zhì)粒DNA 實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染并表達(dá)的更為有效的方式。將細(xì)胞內(nèi)距離細(xì)胞膜5 μm 的范圍劃為細(xì)胞外周，距離細(xì)胞膜大于5 μm 則劃為細(xì)胞內(nèi)周，統(tǒng)計(jì)整個(gè)細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒DNA 熒光強(qiáng)度以及細(xì)胞外周的質(zhì)粒DNA 熒光強(qiáng)度。細(xì)胞邊緣質(zhì)粒DNA 的百分率b為細(xì)胞膜附近5 μm 范圍內(nèi)DNA熒光強(qiáng)度值除以整個(gè)細(xì)胞內(nèi)的DNA 熒光強(qiáng)度值。細(xì)胞中心DNA 的熒光強(qiáng)度值則為1?b。由圖5(c)可知，培養(yǎng)在硬的凝膠基質(zhì)上有更多比例的質(zhì)粒DNA快速向細(xì)胞內(nèi)部轉(zhuǎn)移。

圖5 質(zhì)粒DNA 在細(xì)胞內(nèi)的分布統(tǒng)計(jì)Fig.5 Statistics of plasmid DNA intracellular distribution

圖6 不同剛性基質(zhì)上細(xì)胞骨架蛋白(F 肌動(dòng)蛋白)分布Fig.6 Intracellular distribution of F-actin in cells cultured on different rigidities

2.3 基質(zhì)剛性對(duì)細(xì)胞骨架蛋白的影響

培養(yǎng)在不同剛性凝膠基質(zhì)上的細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的F肌動(dòng)蛋白分布規(guī)律顯著不同。如圖6(a)、圖6(b)未打超聲的對(duì)照組所示，培養(yǎng)在軟的凝膠基質(zhì)上的細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白更多以分散或團(tuán)簇形式分布，而培養(yǎng)在硬的凝膠基質(zhì)上的細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白則以肌動(dòng)蛋白纖維絲的形態(tài)分布。兩種不同剛性基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞在靶向微泡連接位點(diǎn)處均可觀察到小的肌動(dòng)蛋白“團(tuán)聚”現(xiàn)象，表明在靶向微泡連接位點(diǎn)處均有黏著斑形成。超聲激勵(lì)組如圖6(c)、圖6(d)所示，軟的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞在超聲激勵(lì)后40 s 由于球形蛋白分布更有利于細(xì)胞膜流動(dòng)，細(xì)胞膜表面小孔完成修復(fù)，微泡附近的肌動(dòng)蛋白“團(tuán)聚”現(xiàn)象消失。而硬的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞，纖維狀肌動(dòng)蛋白主要起到支撐作用，小孔愈合更多需要借助肌球蛋白運(yùn)動(dòng)等過(guò)程完成，因此細(xì)胞膜上的小孔愈合過(guò)程尚未完成，在靶向微泡位點(diǎn)處可以觀察到更大的蛋白“團(tuán)聚”，推測(cè)這與質(zhì)粒DNA 的攝取方式有關(guān)。軟的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞細(xì)胞膜流動(dòng)性更強(qiáng)，更容易發(fā)生內(nèi)吞作用將質(zhì)粒DNA 攝入細(xì)胞內(nèi)。硬的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞肌動(dòng)蛋白更多以纖維絲狀結(jié)構(gòu)存在，此時(shí)會(huì)預(yù)留更多的時(shí)間供質(zhì)粒DNA通過(guò)小孔進(jìn)入細(xì)胞。

3 結(jié)論

本文實(shí)驗(yàn)研究了基質(zhì)剛性對(duì)質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染效果的影響，并對(duì)質(zhì)粒DNA 導(dǎo)入細(xì)胞的方式進(jìn)行進(jìn)一步研究。獲悉培養(yǎng)在不同剛性基質(zhì)上的細(xì)胞，由于不同種類(lèi)的質(zhì)粒DNA 攝取方式所占比重有所差異，導(dǎo)致DNA 的表達(dá)效果顯著不同，硬的凝膠基質(zhì)上聲致穿孔引發(fā)的細(xì)胞膜小孔可以作為質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染更為有效的途徑，質(zhì)粒的表達(dá)效果也更好。進(jìn)一步的細(xì)胞骨架蛋白分布結(jié)果揭示了不同硬度基質(zhì)上的細(xì)胞攝取質(zhì)粒DNA 方式差異的原因可能來(lái)自于細(xì)胞骨架蛋白的形態(tài)差異，該差異導(dǎo)致軟的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞更容易以非物理小孔的方式將質(zhì)粒DNA 攝入細(xì)胞，而硬的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞則可以更多的通過(guò)聲致穿孔產(chǎn)生的小孔攝入質(zhì)粒DNA。這對(duì)理解細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的物理特性差異引起的基因類(lèi)藥物導(dǎo)入效果差異具有重要的指導(dǎo)意義。但受到實(shí)驗(yàn)條件的限制，未能實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出引起質(zhì)粒DNA 導(dǎo)入的動(dòng)力——微泡對(duì)超聲的動(dòng)力學(xué)響應(yīng)。進(jìn)一步工作將聯(lián)合高速顯微成像系統(tǒng)對(duì)引起質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的動(dòng)力學(xué)因素——微泡振動(dòng)以及微流體剪切力進(jìn)行檢測(cè)分析，深入挖掘基質(zhì)剛性引起質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染差異的原因。基質(zhì)的物理剛性對(duì)細(xì)胞形貌以及力學(xué)特性影響顯著，進(jìn)一步工作將對(duì)基質(zhì)剛性引起的細(xì)胞形貌差異對(duì)質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染差異的影響規(guī)律進(jìn)行研究。